13.06.2013
Enzyme - Individualität statt Konformität; Analyse individueller Enzymmoleküle im Femtoliter-Array
Dr. Hans-Heiner Gorris , Raphaela Liebherr , Universität Regensburg, Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik
Albert Hutterer , Hochschule Regensburg
Enzyme spielen eine wichtige Rolle bei den meisten biochemischen Prozessen, die in unserem Körper ablaufen. In traditionellen Enzymexperimenten wird das durchschnittliche Verhalten einer ganzen Population mit tausenden von individuellen Molekülen beobachtet und analysiert, so dass wir über ein detailliertes Verständnis der Enzymkinetik im Ensemblemaßstab verfügen. Das Verhalten einzelner Enzymmoleküle und ihr Beitrag zur Dynamik einer Enzympopulation bleiben dabei jedoch verborgen. Für ein vollständiges Verständnis des zeitlichen Ablaufs von Enzymreaktionen ist daher nicht nur die Kinetik der Enzympopulation als Ganzes, sondern auch der Anteil jedes einzelnen Enzymmoleküls an der Ensemblereaktion von Bedeutung. Der individuelle Beitrag einzelner Moleküle zur Enzymkinetik eines Ensembles ist bis heute noch wenig erforscht und daher Kernthema vieler wissenschaftlicher Arbeiten. So wurden zum Beispiel kinetische Details, wie eine breite Aktivitätsverteilung innerhalb einer Enzympopulation (statische Heterogenität), Fluktuationen der Enzymaktivität in aufeinanderfolgenden Zyklen (dynamische Heterogenität) sowie Subpopulationen entdeckt.
Dieser Artikel befasst sich mit Einzelenzymstudien, die auf der Umsetzung eines farblosen Substrats in ein fluoreszierendes Produkt beruhen. Alternative optische Methoden, wie beispielsweise der Einsatz von FRET- (Förster Resonance Energy Transfer) Paaren zur Detektion von Einzelmolekülen und nicht-optische Detektionsmethoden der Einzelenzymanalytik, werden aufgrund der großen Methodenvielfalt nicht behandelt. Die Fluoreszenzmikroskopie ist neben der Radioanalytik eine der empfindlichsten Detektionsmethoden, die der biochemischen Forschung zur Verfügung steht. Durch die Entwicklung moderner CCD- und CMOS-Detektoren eignet sie sich hervorragend für die schnelle und hochaufgelöste Aufnahme einzelner Analytmoleküle in sehr kleinen Volumina. In Einzelenzymstudien wird häufig nur eine kleine Anzahl von Fluorophoren gebildet und beobachtet. Daher ist eine Reduktion des Detektionsvolumens essentiell, so dass das Hintergrundsignal aufgrund von Autofluoreszenz und Raman-Streuung des Mediums minimiert wird.