Entwicklung von LC-MS-basierten Metabolomics-Applikationen zur Bestimmung der geographischen Herkunft von Haselnüssen (Corylus avellana)
Klockmann, Sven - Universität Hamburg (2017)
Haselnüsse sind ein wichtiges internationales Handelsgut mit einer Weltjahresernte von 713.000 t (2014), wobei die wirtschaftlich relevanten Anbaugebiete über diverse Länder verteilt sind. Der mengenmäßig größte Teil stammt aus der Türkei, gefolgt von Italien, Georgien, USA sowie Aserbaidschan. Es bestehen zum Teil erhebliche Qualitäts- und damit verbunden Preisunterschiede für Haselnüsse aus den verschiedenen Anbauländern, sodass eine Verfälschung von Waren für kriminell motivierte Unternehmer zur Gewinnmaximierung potentiell sinnvoll erscheinen kann. Derzeit existieren jedoch keinerlei analytische Methoden zur Authentizitätsprüfung in Bezug auf die geographische Herkunft von Haselnüssen, sodass Verfälschungen nicht valide detektiert werden können.
In der vorliegenden Arbeit erfolgte daher die Entwicklung von massenspektrometrischen Metabolomics-Applikationen zur Bestimmung der geographischen Herkunft von Haselnüssen. Zu diesem Zweck wurden 207 authentische Haselnussproben sowie 59 Haselnussproben der Süßwarenindustrie aus den Erntejahren 2014 und 2015 aus wirtschaftlich relevanten Anbauländern akquiriert.
Zu Beginn erfolgte die Entwicklung von non-targeted UPLC-ESI-QTOF-MS Methoden zum hochaufgelösten Screening von Haselnussproben in Bezug auf das polare und unpolare Metabolom. Beim Vergleich verschiedener Methoden erwies sich die Analyse des unpolaren Metaboloms im positiven Ionenmodus als am besten geeignet für die vorliegende Fragestellung. Es wurden 20 Markersubstanzen mit hochsignifikanten Unterschieden zwischen den verschiedenen Ländern identifiziert. Dabei handelt es sich um Lipide der Stoffklassen Phosphatidylethanolamine, Phosphatidylcholine, Diacylglycerole und Triacylglycerole mit unterschiedlichen Fettsäure-Seitenketten sowie γ-Tocopherol.
Auf Basis dieser 20 Markersubstanzen wurde eine targeted HPLC-ESI-QqQ-MS/MS Methode entwickelt, welche die Anforderungen der Routineanalytik in Überwachungs- und Qualitätssicherungslaboratorien in hervorragender Weise erfüllt, wodurch eine spätere Implementierung ohne großen Aufwand ermöglicht wird. Eine umfangreiche Validierung gemäß den Richtlinien der FDA und der DIN 32645 belegte die Robustheit und Sensitivität der entwickelten Methode, welche mit einer Gesamtanalysenzeit (inkl. aller notwendigen Aufarbeitungs- und Messprozesse) von ca. 30-40 min für eine high-throughput Analytik im Metabolomics-Bereich besonders geeignet ist.
Abschließend wurden anhand der authentischen Haselnussproben diverse multivariate Datenanalyseverfahren zur Entwicklung von zuverlässigen statistischen Modellen zur Vorhersage des Herkunftslandes unbekannter Proben getestet und evaluiert. Die besten Ergebnisse konnten mit einem Vorhersagemodell mittels Support Vector Machine Classification erzielt werden, wobei eine Genauigkeit von 100 % erreicht werden konnte. 80 % der Haselnussproben der Süßwarenindustrie konnten auf diese Weise korrekt vorhergesagt werden. Erste Messungen deuteten darüber hinaus darauf hin, dass diese Methode auch auf geröstete Haselnüsse anwendbar ist.