Entwicklung und Anwendung einer neuartigen Methode zur Identifizierung von Back- und Brauhefen mittels MALDI-TOF-MS und der multivariaten Datenanalyse
Becke, Jana Hildegard - Technische Universität Berlin (2018)
Für die Brau- und Backwarenindustrie sind die Hefearten S. cerevisiae und S. pastorianus (ssp. S. carlsbergensis) essentielle Mikroorganismen für die Herstellung von Bier- und Backwaren. Zur Erstellung spezifischer Protein-Fingerprints werden häufig die ribosomalen Hefeproteine untersucht. Sie werden konstitutiv exprimiert und eignen sich daher gut für die Analytik. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist deshalb eine chemische Probenaufarbeitungsmethode entwickelt worden, mit der innerhalb von 25 Minuten Hefeproteine extrahiert werden und an der MALDI-TOF-MS gemessen werden können.
Iterativ sind verschiedene Targets, Matrices sowie unterschiedliche Lösungsmittel- und Analyten-Verhältnisse getestet worden. In Kombination mit der entwickelten Probenaufarbeitung und der verwendeten Matrix a-Cyano-4-hydroxyzimtsäure wird das Probenmaterial im reverse thin layer Verfahren auf ein hochpoliertes Stahltarget aufgetragen. In einer notwendigen Adaption und Weiterentwicklung bereits etablierter diagnostischer Methoden wurden die Parameter an dem MALDI-TOF-MS angepasst. Die Messungen am MALDI-TOF-MS sind im positiven linearen Modus mit einem Nd/YAG Laser im Massenbereich von 2000,36-12999,34 Da durchgeführt worden.
Durch die Kombination der mathematischen Verfahren PCA und SIMCA konnten die Protein-Fingerprints, der 11 Kulturhefestämme der Arten S. cerevisiae, S. pastorianus sowie der Fremdhefen S. diastaticus und Pichia membranifaciens, für eine Differenzierung der verschiedenen Wachstumsstadien eines Hefestammes genutzt werden. In Abhängigkeit von dem eingesetzten Nährmedium ist eine Differenzierung der Hefearten S. cerevisiae, S. pastorianus, S. diastaticus und Pichia membranifaciens auf Stammebene möglich gewesen. Auf Artebene war eine vollständige Differenzierung sowohl im SD-Medium und den Vollmedien möglich.
Anhand spezifischer Protein-Fingerprints der Art S. cerevisiae konnten in weiteren Versuchen die beiden Prozessstufen der Stell- und Versandhefefermentation differenziert werden. Ebenfalls war eine Differenzierung der unterschiedlichen Erntehefen verschiedener Fermentationszyklen der Art S. pastorianus (ssp. carlsbergensis) möglich. Zur Überprüfung der Forschungsergebnisse wurde die etablierte molekularbiologische PCR-Methode mit spezifischen δ12/δ21-Primern angewendet.