Identifizierung gering konzentrierter diagnostischer Glykoproteine in humanem Plasma mittels Affinitäts-Chromatographie und Massenspektrometrie
Seyed Mortezai, Naghmeh - Universität Hamburg (2010)
Das Ziel der vorliegenden Dissertation war die Entwicklung eines empfindlichen Verfahrens, das es ermöglichen soll, gering konzentrierte diagnostisch relevante Glykoproteine in humanem Plasma zu identifizieren, ohne dass deren Identität im Vorhinein bekannt ist. Hierfür wurden zwei affinitäts-chromatographische Schritte miteinander kombiniert.
Zunächst wurde eine Anreicherung der im Plasma verhandenen Glykoproteine aus einem Pool gesunder Kontrollpersonen über eine Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Affinitäts-Chromatographie vorgenommen. Durch die Lektinfraktionierung des humanen Plasmas konnten ca. 96 % der gesamten Plasmaproteinmenge abgetrennt werden. Um die Analyse gering konzentrierter Plasmaproteine in der WGA-gebundenen Fraktion zu ermöglichen, war eine selektive Abtrennung von regulär vorkommenden Proteinen der Glykoproteinfraktion erforderlich. Die WGA-gebundene Plasmaproteinfraktion Gesunder wurde für die Immunisierung eines Lamas eingesetzt, um hochspezifische Antikörper gegen die Glykoproteine des Normalplasmas zu erhalten. Cameliden (Kamele und Lamas) bilden neben konventionellen Antikörpern eine besondere Form von Antikörpern, bei denen die leichte Kette und die CH1Domäne deletiert sind. Diese sogenannten Schwerketten-Antikörper besitzen im Vergleich zu konventionellen Antikörpern eine höhere chemische und thermische Stabilität.
Durch die gerichtete Immobilisierung der Schwerketten-Antikörper an eine HydrazidMatrix wurde ein Immunabsorbens mit hoher Stabilität hergestellt, das bis zu 98 % der WGA-gebundenen Plasmaproteine binden konnte. Da die Cameliden-Antikörper nur gegen Glykoproteine gerichtet sind, die in Normalplasma vorkommen, sollten Proteine, die die WGA-gebundene Proteinfraktion aus Normalplasma nicht enthält, nicht gebunden werden.
Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde ein glykosyliertes Testprotein eingesetzt, das Carcinoembryonale Antigen (CEA), das im Plasma Gesunder nur in sehr geringen Mengen vorkommt, dessen Plasmakonzentration jedoch beim Kolonkarzinom stark erhöht ist. Ein Plasma-Pool aus gesunden Kontrollpersonen wurde mit CEA (20 pmol/ml) versetzt, die WGAgebundene Glykoprotein-Fraktion isoliert und eine Abreicherung der Proteine des Normalplasmas mit der im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Matrix aus immobilisierten Cameliden-Schwerketten-Antikörpern durchgeführt. Hierbei wurde das CEA nicht signifikant vom Immunabsorbens gebunden. Im Durchlauf der Immun-Affinitäts-Chromatographie konnte das CEA mittels einer LCMSE-Analyse detektiert werden. Anschließend wurden die WGA-gebundenen Plasmaproteinfraktionen von zwei Kolonkarzinompatienten über das Immunabsorbens aufgearbeitet. Auch in diesem Fall konnte das CEA im Durchlauf der Affinitäts-Säule angereichert und mittels der LCMSE-Analyse detektiert werden.
Durch den Einsatz derartiger Affinitäts-Säulen eröffnet sich daher die Möglichkeit, durch die Abreicherung der im Plasma Gesunder regulär vorkommender Glykoproteine eine entsprechende Anreicherung von diagnostisch relevanten gering konzentrierten Markerproteinen zu erreichen. In jedem Fall muss das diagnostisch relevante Glykoprotein Glykan Reste tragen, die eine spezifische Bindung zum Lektin erlauben und in der angereicherten Glykoproteinfraktion mit einer Konzentration von ≥ 20 pmol/ml vorkommen.