Quantitative Analyse der Proteinadsorption an Primärpackmittel
Rager, Julia - Freie Universität Berlin (2013)
Proteintherapeutika werden häufig in lyophilisierter Form gelagert, um die Stabilität über eine längere Dauer zu gewährleisten. Vor Applikation in den Patienten wird durch Rekonstitution die fertige Proteinlösung erhalten. Durch Adsorption des Proteins an das Primärpackmittel kann es zu einem Konzentrationsverlust in Lösung kommen. Dies stellt sowohl für den Therapieerfolg als auch für die pharmazeutische Industrie ein Problem dar. In der Literatur wurde bereits die Adsorption verschiedener therapeutischer Proteine an verschiedene Primärpackmittel beschrieben. Durch unterschiedliche Eigenschaften des Proteins als auch der Primärpackmitteloberfläche sowie durch variierende Formulierungsparameter ist keine Aussage über die adsorbierte Proteinmenge möglich. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit unter Einsatz des Modellproteins BSA die folgenden drei analytischen Methoden entwickelt, um die adsorbierte Proteinmenge an verschiedene Primärpackmittel zu quantifizieren:
- Coomassieblau-Assay
- Micro BCA-Assay
- SE-HPLC Methode
Beim Coomassieblau-Assay zeigte sich jedoch, dass die erhaltenen Kalibriergeraden sowohl von dem untersuchten Primärpackmittel als auch vom pH-Wert der inkubierten Lösung abhängig waren. Da somit für jeden variierenden Formulierungsparameter sowie für unterschiedliche Primärpackmittel stets neue Kalibriergeraden aufgestellt werden müssten, wurde dieser Ansatz aufgrund des hohen Arbeitsaufwandes nicht weiterverfolgt.
Die statistische Versuchsplanung stellt durch gleichzeitige Variation verschiedener Faktoren eine schnelle und effiziente Methode dar, um beispielsweise den Einfluss verschiedener Faktoren auf die adsorbierte BSA-Menge zu untersuchen. Außerdem ist es mittels statistischer Versuchsplanung möglich, Aussagen über Wechselwirkungen von Faktoren zu machen. Dies ist ein weiterer Vorteil gegenüber dem klassischen Versuchsaufbau, bei dem nur ein Faktor pro Versuch variiert wird. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit ein zentral zusammengesetzter Versuchsplan genutzt, um signifikante Faktoren und Wechselwirkungen auf die adsorbierte BSA-Menge zu identifizieren. Zudem konnte in diesem Rahmen die Anwendbarkeit der entwickelten Methoden bestätigt werden.
Untersucht wurde der Einfluss folgender Faktoren auf die BSA-Adsorption an Primärpackmitteloberflächen:
- BSA-Ausgangskonzentration
- Ionenstärke des Puffers
- Inkubationstemperatur
- Inkubationsdauer
- Vialart
Als Zielgröße diente die adsorbierte BSA-Menge, die sowohl mittels Micro BCA-Assay als auch mittels SE-HPLC quantifiziert wurde. Der pH-Wert wurde für alle Versuche auf den isoelektrischen Punkt von BSA eingestellt, um eine durch beide Methoden messbare, adsorbierte BSA-Menge sicherzustellen.
Die statistischen Analyse identifizierte folgende wichtige Einflussfaktoren auf die adsorbierte BSA-Menge:
- BSA-Ausgangskonzentration
- Ionenstärke des Puffers
- Vialart
- Wechselwirkung zwischen der Ionenstärke des Puffers und der Vialart
Die Vialart zeigte dabei den größten Einfluss auf die adsorbierte BSA-Menge.
Zusammenfassend zeigt diese Arbeit Methoden, um die Proteinadsorption an Primärpackmittel schnell und kosteneffizient zu untersuchen. Darüber hinaus stellt die statistische Versuchsplanung einen effektiven Ansatz zur Identifizierung eventueller Einflussfaktoren auf die Proteinadsorption dar.