Steigerung der Signalstärke und der Photostabilität von Fluorophoren in der Einzelmolekülspektroskopie
Pfiffi, Daniela - Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf (2011)
In Einzelmolekül-Fluoreszenzexperimente wird die Signalstärke und Photostabilität der verwendeten Fluorophore hauptsächlich durch Übergänge in nicht fluoreszierende Dunkelzustände wie den Triplettzustand oder Radikalzustände limitiert. Wird die Bevölkerung der beiden Zustände unterdrückt oder die Geschwindigkeitskonstante der Deaktivierung erhöht, kann die Signalstärke des Farbstoffs auf die des theoretisch erreichbaren 2-Niveausystems steigen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden in der vorliegenden Arbeit neue Verbindungsklassen als Additive eingesetzt, die in der Lage sind, über Energie- und Elektronentransfermechanismus gleichzeitig beiden Dunkelzustände des Fluorophors löschen.
Es wurden Verbindungen aus den Substanzklassen der Diphenylhexatriene, Cyclooctatetraene und Azobenzole hinsichtlich ihrer Eignung als photoprotektive Additive für den Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin 123 untersucht. Die Fluoreszenzkorrelations-spektroskopie erlaubte einen detaillierten Einblick in die Löschmechanismen und in photophysikalische und photochemische Prozesse von Rhodamin 123.
Die maximale Steigerung des Fluoreszenzsignals um einen Faktor fünf erzielte ein Azobenzolderivat, dass neben einem sehr effizienten Triplettenergietransfer gleichzeitig in der Lage war, das durch Photooxidation entstandenen Radikalkation von Rhodamin zu reduzieren. Die detaillierte Analyse der konzentrationsabhängigen Oxidationsprozesse ermöglichte die Bestimmung der separaten Geschwindigkeitskonstanten der Oxidationsprozesse aus dem ersten angeregten Singulett- und Triplettzustand. Dabei zeigten einige Löschmoleküle eine Tendenz zu Elektronentransferreaktionen, die die Bildung von Radikalzuständen fördern.
Durch stationäre Photozerstörungsmessungen konnten verschiedenen Mechanismen, die zur irreversiblen Zerstörung des Rhodamins führen, aufgeklärt werden. Messungen in Abwesenheit von Luftsauerstoff erlaubten erstmals die Quantifizierung des Einflusses von gelöstem Sauerstoff auf die Photozerstörung. Wurde der Triplettlöschers Sauerstoff durch Additive wie Azobenzole oder Cyclooctatetraen-Derivate ersetzt, konnte die Geschwindigkeit der Photozerstörung um das fünfzigfache verringert werden.
Das Azobenzolderivat zeigte auch bei Fluoreszenzfarbstoffen, die im roten Spektralbereich absorbieren (z.B. Atto 647N) und daher geringere Triplettenergien besitzen, eine gute Triplettlöscheffizienz. Anhand von fluoreszenzmarkierten DNA-Proben konnte Anwendbarkeit der photoprotektive Additive auf biologische Systeme bestätigt werden.
In Bichromophoren, in denen eine photoprotektive Gruppe kovalent an den Fluorophor gebunden wurde, konnte ein komplexer Mechanismus von Energie- und Elektronentransfer beobachtet werden. Durch die Kopplung eines Azobenzolderivats an ein Rhodamin-Grundgerüst fand in sauerstofffreier Umgebung eine Signalsteigerung aufgrund eines intramolekularen Triplettenergietransfers statt.
Die Resultate dieser Arbeit zeigen, dass beim Einsatz von photoprotektiven Additiven zur Steigerung des Fluoreszenzsignals verschiedene Elektronen- und Energietransferreaktionen berücksichtigt werden müssen. Bei der Auswahl eines geeigneten Löschmoleküls sind detaillierte Kenntnisse über die photophysikalischen und photochemischen Prozesse des Fluoreszenzfarbstoffs erforderlich. Auf diese Art können durch Additive induzierte Übergänge in unerwünschte Dunkelzustände vermieden werden.
Die untersuchten Systeme zeigten sowohl in biologischer Umgebung erfolgreiche Wirkung als auch bei gebräuchlichen Akzeptorfarbstoffen gute Effekte und sind daher auch für den Einsatz in Einzelmolekül-FRET-Experimenten geeignet.