Stationäre und mobile Verfahren zur Detektion und Differenzierung biologischer Toxine
Hansbauer, Eva-Maria - Freie Universität Berlin (2016)
Biologische Toxine sind aufgrund ihrer Toxizität und ihres Vorkommens von hoher Relevanz im Gesundheits-, Lebensmittel- und Sicherheitsbereich. Akzidentelle und intentionale Intoxikationen haben das Potential, schwerwiegende Krankheitsbilder zu induzieren, welche letal verlaufen können. Ein schneller, sensitiver und spezifischer Nachweis der auslösenden Proteine ist entscheidend, um adäquate Schutzmaßnahmen und Behandlungsoptionen zu ergreifen. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Entwicklung von stationären und mobilen immunologischen Nachweissystemen für Staphylokokken Enterotoxin A (SEA), Abrin und die Botulinum Neurotoxine BoNT/A, /C, /CD, /D, /DC und /E. Technisch herausfordernd ist das sichere Erfassen von Toxinen, die in komplexen Gruppen nahverwandter, funktionell ähnlicher Moleküle vorkommen und - je nach Fragestellung - differenziert werden müssen. Im Rahmen der Arbeit wurden, basierend auf 10 Hybridoma-Fusionen, insgesamt 25 monoklonale Antikörper (mAk), die die genannten Toxine spezifisch und hoch-affin binden, isoliert und umfassend charakterisiert. Die neuen Reagenzien wurden verwendet, um stationäre (laborbasierte) und mobile (vor Ort) Detektionsverfahren zu etablieren.
Für die humanpathogenen BoNT/A und /E gelang beispielsweise die Entwicklung von Sandwich ELISAs, welche alle in der Gruppe vorhandenen Subtypen nachweisen. Ausgewählte mAk waren in der Lage, BoNT/A sowie ein kürzlich neu identifiziertes Mosaiktoxin BoNT/H in vitro zu neutralisieren. Mit Hilfe der anti-Abrin mAk gelang die Differenzierung zwischen Abrin-a und dem nahverwandten, aber deutlich weniger toxischen Abrus Agglutinin. Alle etablierten Toxin-spezifischen Sandwich ELISAs erwiesen sich als äußerst sensitiv mit Nachweisgrenzen zwischen 2 und 30 pg/ml Toxin, was mehrere Größenordnungen unterhalb der halbletalen Dosen für Menschen liegt. Durch die neu generierten Antikörper gegen veterinärpathogene BoNT (Serotypen C, D und ihre Mosaikvarianten CD und DC) gelang erstmalig eine eindeutige Differenzierung der Toxine auf Basis von vier Sandwich ELISAs. Die Ergebnisse konnten auf funktioneller Ebene bestätigt werden, indem die Mosaiktoxine einer Kombination aus Immunoaffinitätsanreicherung, enzymatischem Aktivitätstest und massenspektrometrischer Analyse unterzogen wurden. Eine umfassende Validierung der vier differenzierenden ELISAs im Vergleich zu funktionellen (Endopep-MS Assay) und genetischen Methoden (PCR) bei Testung von mehr als 90 Clostridien-Stämmen und veterinärpathogenen Realproben ergab eine 100%-ige Überein-stimmung der Ergebnisse.
Zur Etablierung eines schnellen und einfachen Multiplex-Detektionssystems, das von Einsatzkräften vor Ort eingesetzt werden kann, wurden die Antikörper gegen SEA, BoNT/C, /D, /E und Abrin in die vollautomatisierte Detektionsplattform pTD, einem elektrischen Biochipsystem, implementiert. Die fünf Toxine konnten simultan oder einzeln innerhalb von 20 min Messzeit mit ausreichender Sensitivität und einem Detektionslimit zwischen 0,5 und 17,5 ng/ml detektiert werden. Das pTD System erfasste die Toxine in ausgewählten dotierten Umwelt- oder Lebensmittelproben ohne Kreuzreaktivitäten. In einer Anwenderübung wurde die pTD Plattform erfolgreich durch Einsatzkräfte von Polizei und Feuerwehr auf Praxistauglichkeit geprüft. Auf Basis der erhaltenen Ergebnisse soll der hier entwickelte Biochip zur Detektion von SEA, BoNT/C, /D, /E und Abrin in Kürze durch den industriellen Kooperationspartner kommerzialisiert werden.
Insgesamt wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit qualitativ hochwertige mAk zum Nachweis von SEA, Abrin, BoNT/A, /C, /CD, /D, /DC und /E etabliert und umfassend charakterisiert, mit denen bestehende Fähigkeitslücken im Bereich stationärer und mobiler Detektionssysteme geschlossen wurden.