Nanopartikel als Verstärkungsstrategie in fluoreszenzbasierten Immunoassays
Quevedo, Pablo Daro - Freie Universität Berlin (2018)
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von fluoreszenten Farbstoffnanopartikeln, welche als Label in einem Immunoassay eingesetzt werden und die Signalintensität und Sensitivität des Assays steigern sollten. Dafür wurden systematische Verkapselungsstrategien für verschiedene neutrale und ionische/ geladene Farbstoffe untersucht und systematische Untersuchungen zu Einflussgrößen wie Nanopartikelgröße, Biokonjugation und Farbstoffbeladungskonzentration durchgeführt.
Es wurden zwei unterschiedliche Partikelsysteme hergestellt und in Bezug auf ihre reproduzierbare Herstellung und spätere Eignung für den Einsatz als Nanopartikellabel in Immunoassays systematisch untersucht. Dabei stellten sich aufgrund ihrer Stabilität, ihrer einfachen und reproduzierbaren Herstellung, ihrer engen und definierten Größenverteilung, ihrer ausreichend funktionellen Oberflächengruppen und durch die Möglichkeit die Farbstoffmenge im NP präzise einzustellen, farbstoffbeladene Polystyrolpartikel als besonders geeignet heraus. Für die Anbindung von SAv an amino- und carboxyfunktionalisierte Polystyrolnanopartikel wurden zwei verschiedene Kopplungssmethoden, die Anbindung über EDC/ sulfo-NHS und über einen heterobifunktionellen PEG-Linker, getestet. Beide Kopplungsstrategien sind geeignet, um Streptavidin an die Partikeloberfläche zu binden unter Vermeidung von NP-Aggregation. Die Mengen an partikelgebundenem SAv wurden mithilfe des BCA- und Biotin-FITC-Assays bestimmt. Da beide Assays vorrangig für die Quantifizierung von Proteinen in Lösung entwickelt wurden, mussten beide Assays erst auf mögliche Wechselwirkungen mit Farbstoffen und der Partikelmatrix sowie Störeinflüsse durch die Partikelstreuung und spektrale Interferenzen mit den Kodierungsfarbstoffen untersucht werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass einige Farbstoffe den Kupfer(II)-BCA-Komplex reduzieren und es folglich zu einer Überbestimmung von Streptavidin kommt.
Weiterhin konnten Farbstoffe wie meso-Tetraphenylporphyrin identifiziert werden, die mit Streptavidin wechselwirken und dadurch die Biotin-Anbindung stark beeinträchtigen, sodass es bei der Biotin-FITC-Titration zu einer Unterbestimmung von funktionalem Streptavidin kommt. Durch das Anbinden von SAv über einen PEG-Linker konnte die NP-Oberfläche abgeschirmt werden, sodass die Wechselwirkungen von an der NP-Oberfläche befindlichem meso-Tetraphenylporphyrin mit SAv reduziert und die Funktionalität von Streptavidin erhalten werden konnte. [...]