Entwicklung eines Massenspektrometrie-basierten Verfahrens zur Quantifizierung von HIV-Strukturproteinen und deren Stöchiometrie für neue analytische Anwendungen
Luckau, Luise - Technische Universität Braunschweig (2019)
In der Virusdiagnostik und -forschung ist die Verfügbarkeit von genau charakterisierten viralen Referenzmaterialien von Bedeutung, da sie vor allem die Messgenauigkeit verbessern. Ein Ziel ist die genaue Quantifizierung der für den Aufbau von Viren relevanter Biomoleküle, der viralen Nukleinsäure, der funktionalen viralen Proteine, sowie deren Verhältnisse.
Die derzeit metrologisch genauesten Methoden im Bereich der Nukleinsäure-Quantifizierung ist die digitale PCR (z. B. droplet digital PCR: ddPCR) und in der Protein-Quantifizierung die Isotopenverdünnungs-Massenspektrometrie (IDMS). Beide Verfahren wurden für die HIV-Quantifizierung auf ein in vitro hergestelltes Virusmaterial angewendet. Bei dem direkten Vergleich beider Methoden bezüglich der Wiederholbarkeit von Messungen erreichte die ddPCR eine technische Präzision von ± 0,7 % und die IDMS von ± 2,5 %. Dagegen konnte mit der IDMS aufgrund der internen Standardisierung mit ± 2 % eine bessere Reproduzierbarkeit der Komplettanalysen im Vergleich zur ddPCR mit ± 3,8 % erzielt werden.
Auf der Basis von ersten Peptide-Mapping-Analysen des HIV-Materials wurde das IDMS-Verfahren bezüglich der Quantifizierung des Gag-Polyproteins (GAGp55) etabliert, das als Vorläuferprotein alle viralen Strukturproteine Matrix (MAp17)-, Capsid (CAp24)- und p6-Protein enthält.
Das gefundene Mengenverhältnis von MAp17, CAp24 und p6 weicht vom erwarteten äquimolaren Verhältnis ab, was auf alternative Translationsmechanismen rückzuführen ist. Aufgrund eines IRES (internal ribosomal entry site) -abhängigen Translationsmechanismus können MAp17-trunkierte Gag-Proteinvarianten entstehen, weshalb die MAp17-Menge im Vergleich zu CAp24 um ~20 % reduziert ist. Die Ursache für um ~30 % reduziertes p6 im Vergleich zu CAp24 ist womöglich ein RNA-Sequenzmotiv, das bekannterweise die ribosomale Leserahmenverschiebung für die Gag-Pol-Synthese verursacht. Da die Quantifizierung von Viren als komplexe Strukturen eine Herausforderung darstellt, auch bezüglich der Verwendung des Quantifizierungsstandards, wurde ein Lysin- und Arginin-isotopenmarkiertes HIV-Material mittels SILAC (stable isotope labeling by amino acids in cell culture) hergestellt, das chemisch genauso aufgebaut ist wie das natürliche HIV-Material. Dieses Material kann nach umfassender Charakterisierung in Zukunft für die relative und absolute Quantifizierung eingesetzt werden.