Physiologische und biochemische Charakterisierung zweier Zuckertransporter des biotrophen Maispathogens Ustilago maydis
Wippel, Kathrin - Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (2011)
Gegenstand dieser Arbeit war die Charakterisierung von zwei Transportproteinen, UmHxt1 und UmSrt1, aus dem biotrophen Maispathogen Ustilago maydis. Im Vorfeld durchgeführte Analysen hatten ergaben, dass Deletionsmutanten der beiden entsprechenden Gene hxt1 und srt1 nach Infektion von Maispflanzen einen ausgeprägten Pathogenitätsphänotyp zeigten, bei dem es zu drastisch reduzierten Infektionssymptomen kam. Des Weiteren ging aus Expressionsstudien hervor, dass hxt1 konstitutiv, srt1 hingegen spezifisch in der Infektionsphase exprimiert wird, was auf eine spezielle Rolle von Srt1 während der Infektion schließen ließ, welche ebenfalls untersucht wurde.
Durch heterologe Expression der Gene in Bäckerhefe und anschließende Aufnahmemessungen mit radioaktiven Substraten wurden die Transporteigenschaften von Hxt1 und Srt1 bestimmt. Fluorophorfusionen beider Proteine wurden in der PM der Hefezellen lokalisiert, was diese Experimente ermöglichte. Hxt1 ist ein hochaffiner MST mit einem Km-Wert von 18 µM für Glc. Srt1 ist ein hochaffiner ungewöhnlich spezifischer Suc-Transporter mit einem Km-Wert von 26 µM für Suc. Er ist der erste bislang beschriebene Suc-Transporter aus Pilzen. Phylogenetische Analysen belegten zudem, dass Srt1 ein neuartiges Suc-Transportprotein darstellt, das näher verwandt zu pflanzlichen und pilzlichen MSTs als zu den pflanzlichen SUCs ist. Damit übereinstimmend weist Srt1 einen MST-ähnlichen Transportmechanismus auf, der bei hohen Innenkonzentrationen auch Export von Suc zulässt.
Die Rolle von Srt1 während der Infektion wurde durch die Komplementation der Ustilago-Mutante ?srt1 durch pflanzliche SUCs erforscht. AtSUC9 war in der Lage, die Pathogenität von ?srt1 wiederherzustellen, was den Schluss zulässt, dass der Suc-Transport alleine ausreichend und essentiell für die Pathogenität von Ustilago und folglich auch die Funktion von Srt1 ist.
Im Gegenzug wurde durch die Komplementation der Arabidopsis thaliana suc2-Mutante getestet, welche Transporteigenschaften nötig sind, um die Funktion von AtSUC2 bei der Phloembeladung zu ersetzen. Srt1 und AtSUC1 wurden hierfür verwendet, da Srt1 sich vor allem im Km-Wert und im Transportmechanismus, AtSUC1 sich hingegen in der pH-Abhängigkeit von AtSUC2 unterscheidet. Die Srt1- und AtSUC1-Transkripte bzw. -Proteine und deren korrekte Lokalisation in planta wurden durch RT-PCR bzw. Immunolokalisierung mit spezifischen Srt1- bzw. SUC1-Antikörpern nachgewiesen. Die Transportaktivität von Srt1 in Arabidopsis-Protoplasten wurde durch Aufnahme radioaktiver Suc gezeigt. Beide Gene wurden unter der Kontrolle des geleitzellspezifischen AtSUC2-Promotors exprimiert, jedoch konnte nur AtSUC1 den Entwicklungsphänotyp von Atsuc2 komplementieren.
Weiterhin wurde der Einfluss von Redox-Agenzien auf die Aktivität von Srt1 untersucht, da reduzierende Substanzen reversibel auf den inhibitorischen Effekt des sulfhydrylgruppenmodifizierenden Agens' PCMBS wirken, Srt1-vermittelter Suc-Transport jedoch PCMBS-unabhängig ist. Alle getesteten reduzierenden oder oxidierenden Substanzen hatten sowohl auf Srt1 als auch auf StSUT1 aus Kartoffel und auf ZmSUT1 aus Mais einen richtungsgleichen, und zwar nur schwach inhibitorischen Einfluss. Im Zuge dieser Analysen wurde jedoch deutlich, dass die Srt1- und ZmSUT1-Aktivität unterschiedliche pH-Abhängigkeiten aufweisen, die bei der Ustilago/Mais-Interaktion an der Interaktionszone regulatorische Funktion haben könnten.
In einem Nebenprojekt wurden T-DNA-Insertionslinien bezüglich der beiden Gene der Polyol/Monosaccharid-Transporter AtPMT3 und AtPMT6 aus Arabidopsis charakterisiert und die subzelluläre Lokalisation von PMT6 in Hefen modifiziert. Sowohl Einzel- als auch Doppel-knockout-Pflanzen zeigten keine offensichtlichen Unterschiede zum Wt. Versuche, durch verschiedene Deletions- und Fusionsansätze den in Hefen in internen Strukturen lokalisierten PMT6 in die PM zu bringen, um dadurch das Protein mittels radioaktiver Aufnahmemessungen charakterisieren zu können, lieferten keine positiven Resultate.