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Untersuchung der Katalyseeigenschaften und strukturellen Dynamik von Proteinen und Proteinkomplexen mit Einzelmolekül- Fluoreszenzspektroskopie

Rohrbeck, Daniel - Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf (2014)


Die Funktionalität von Proteinen ist abhängig von Struktur und Flexibilität. Diese befinden sich dabei in einer kontinuierlichen Bewegung zwischen verschiedenen konformellen Zuständen vergleichbarer Energien. Bestimmte Trigger, wie Liganden, beeinflussen dieses Gleichgewicht, indem sie konformelle Strukturänderungen des Proteins induzieren. Grundlegende Proteindynamiken sind die Scharnier- und Scherbewegungen, jedoch existieren auch komplexere Bewegungsabläufe, wie Domäneninteraktionen mit verschiedenen aktiven Zentren oder partieller Entfaltung. Untersuchungen dieser konformellen Änderungen und deren Dynamik liefern Rückschlüsse auf den funktionellen Ablauf.

Für diese Arbeit wurde mit fluoreszenzspektroskopischen Methoden die strukturelle Dynamik von Proteinen an vier verschiedenen Modellsystemen untersucht. Ein Vertreter der Liganden-induzierten Scharnierbewegung ist die homodimere Anthranilat-Phosphoribosyltransferase aus dem hyperthermophilen Sulfolobus solfataricus (ssAnPRT). Es wurden Cystein-Proteinvarianten zur Fluoreszenzmarkierung gefunden, die ein dynamisches Proteinkonstrukt aufzeigten. Die Magnesium-induzierte Scharnierbewegung des Enzyms liegt bei Raumtemperatur im Mikrosekunden-Bereich und wurde mit einer Kombination aus Photon Distribution Analysis und Fluoreszenzkreuzkorrelation verifiziert. Somit war es möglich, ein dynamisches Modell der Katalyse für ssAnPRT zu entwickeln.

Die Nukleotid-bindende Domäne (NBD) des aus Lactococcus lactis stammenden integralen Membranproteins Lactococcal multidrug resistance protein A (LmrA) ist ein weiterer Vertreter von Proteinen der Scharnierbewegung. Zudem wurde für die Transmembran- Domäne (TMD) eine Scherbewegung vermutet. Dynamische Strukturänderungen während des Transportzyklus von Substraten konnten gezeigt werden. Ein Modell des Transportmechanismus ist weiterhin unbekannt. Das Postsynaptic Density Protein 95 (PSD-95) gehört zu den Membran-assoziierten Guanylat-Kinasen. Aufgrund seiner Eigenschaft als Gerüstprotein ist es ein hochdynamisches Proteinkonstrukt, dessen vernetzende Eigenschaften mit anderen Proteinen ein wichtiges Element der Signaltransduktion ist. Mit Hilfe der Einzelmolekül-Fluoreszenzspektroskopie und der damit assoziierten Spezies-selektiven Fluoreszenzkreuzkorrelation konnte die Proteindynamik quantifiziert und ein Modell der Domänenverknüpfungen etabliert werden.

Im letzten Teilprojekt wurde am Lysozym des T4 Phagen der strukturelle und dynamische Entfaltungsprozess untersucht. Während der Harnstoff-induzierten Denaturierung konnten Intermediatzustände nachgewiesen werden. Des Weiteren wurden Hinweise auf den sogenannten "communication link" zwischen Helix A und E der N- und C-terminalen Subdomänen gefunden. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass bei vollständiger Denaturierung das Protein nicht strukturlos ist, sondern eine neue Sekundärstrukturlose Tertiär- oder Quartärstruktur existiert.


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