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Analytik und Vorkommen lebensmittelrechtlich relevanter mariner Biotoxine unter besonderer Berücksichtigung von Ciguatoxinen (CTXs) und Yessotoxinen (YTXs)

Röder, Karin - Friedrich-Schiller-Universität Jena (2010)


Bei der Lebensmittelerzeugung soll durch das Einhalten bestimmter Hygienevorschriften für den Verbraucher weltweit ein hohes Niveau des Gesundheitschutzes gewährleistet werden.

Dies ist für Lebensmittel tierischen Ursprungs, besonders für Fischereiprodukte, von großer Bedeutung, da diese besonders stark mikrobiellem Verderb ausgesetzt sind. Weniger bekannt ist jedoch, dass Lebensmittel mariner Herkunft auch mit marinen Biotoxinen kontaminiert sein können. Folglich ist für den Verbraucherschutz neben der Regelung bestimmter Prozessbedingungen, welche u.a. die Produktion, den Transport und die Lagerung betreffen, die Kontrolle auf Kontaminanten wie den marinen Biotoxinen in Fischereiprodukten, essentiell. In diesem Zusammenhang wurden durch die EUVerordnung (EG) Nr. 853/2004 die maximal zulässigen Höchstmengen an Amnesic Shellfish Poisoning (ASP) und Paralytic Shellfish Poisoning (PSP)Toxine sowie an lipophilen marinen Biotoxinen (Okadasäure (OA), Dinophysistoxine (DTXs), Yessotoxine (YTXs), Pectenotoxine (PTXs) und Azaspirazide (AZAs)) durch Höchstmengen geregelt. Außerdem gilt für Tetrodotoxin (TTX) und Ciguatoxine (CTXs) ein generelles Einfuhrverbot für belastetes Material. Dieses wird im Fall von TTX dadurch gewährleistet, dass bestimmte Spezies, welche ein hohes Risiko bzgl. einer TTXBelastung darstellen, nicht eingeführt werden dürfen. Allerdings ist ein generelles Einfuhrverbot für möglicherweise mit CTXs kontamienierten Fische nicht möglich, da sehr viele darunter besonders karnivore tropische Fischarten CTXs sehr stark akkumulieren können. Durch die Zunahme von "Algenblüten" ("Harmful Algal Blooms" HAB's) und die weltweit erhöhte Nachfrage nach tropischen Fischen wurde es notwendig, Analysenverfahren zu entwickeln, welche den schnellen, empfindlichen und vor allem eindeutigen Nachweis mariner Biotoxine ermöglichen. Unabhängig davon bleibt der Mausbioassay (MBA) das offizielle Untersuchungsverfahren zur Kontrolle von Seafood auf marine Biotoxine, auch wenn neben dem Tierversuch weitere Methoden zur Testung auf Biotoxine, d.h. auch zur Bestimmung der in dieser Arbeit besonders betrachteten marinen Biotoxinen angewandt werden.

In den letzten Jahren waren es vorrangig LCMS/MSbasierte Methoden, die u.a. auch zum Nachweis und zur Strukturaufklärung mariner Biotoxine eingesetzt wurden. Folglich sollten LCMS/MSMethoden entwickelt werden, welche für die Analyse der VorläuferCTXs aus Gambierdiscus spp. und mit geringfügigen Modifikationen auch für die Detektion der polareren CTXs aus Fischen einsetzbar sind. Aufgrund der fehlenden Verfügbarkeit eines CTXStandards wurden die MSMessungen zunächst mit den strukturähnlichen marinen Biotoxinen YTX und Brevetoxinen (BTXs) sowie mit einem Extrakt von G. toxicus durchgeführt. Nachfolgend konnten die LCMS/MS Parameter so sehr optimiert werden, dass eine geeignete SIM sowie eine MRMMethode zum Nachweis von CTXs eingeführt werden konnte. Durch die anschließende Analyse des Toxinprofils verschiedener Spezies der Gattung Gambierdiscus konnte gezeigt werden, dass sich die aus verschiedenen Regionen stammenden Stämme hinsichtlich ihres Toxinprofiles charakteristisch unterscheiden und, dass die Produktion von CTXs durch die Veränderung der Salinität modifiziert werden kann.

Die Untersuchung der Bildung von YTXs ist ebenfalls von großer Bedeutung für die Lebensmittelüberwachung. Auch wenn die Toxizität der YTXs im Vergleich zu den anderen DSPToxinen relativ gering ist, bleibt es weiterhin notwendig zu untersuchen, welche YTXAnaloga vom Phytoplankton gebildet und welche davon von Schalentieren akkumuliert und metabolisiert werden.

Bis heute ist nicht eindeutig geklärt, aus welchen Gründen marine Biotoxine von Dinoflagellaten gebildet werden. Es wird u.a. vermutet, dass die Produktion der Toxine als Ergebnis der Evolution einen Überlebensvorteil darstellt. Die Veränderung des Klimas sowie der Nährstoffverfügbarkeit in küstennahen Gebieten scheinen Ursache vermehrter Blüten toxischen Phytoplanktons zu sein. Teilweise ist die Produktion der Toxine zwar genetisch determiniert, jedoch haben Kultivierungsbedingungen einen großen Einfluss auf das Wachstum der Algen sowie die gebildete ToxinMenge. Da bisherige Untersuchungen keine eindeutigen Ergebnisse bzgl. des Einflusses dieser Bedingungen auf die Toxinproduktion von P. reticulatum ergaben und betreffende Aussagen von Bedeutung für Risikoeinschätzungen sind, war es ein weiteres Ziel dieser Arbeit, zu untersuchen, wie sich Veränderungen der ökologischen Parameter auf das Wachstum und die Toxinproduktion von P. reticulatum auswirken. In Auswertung der durchgeführten Studien konnte gezeigt werden, dass steigende Temperaturen die Wahrscheinlichkeit für eine Blüte des in der Nordsee endemischen Dinoflagellaten nicht erhöhen würden. Die Produktion von YTX durch den Dinoflagellaten P. reticulatum scheint vielmehr direkt mit dem Lebenszyklus und der Teilungsrate zusammenzuhängen. Außerdem zeigte sich, dass eine PLimitierung bei dieser Spezies zu hohen Toxinkonzentrationen pro Zelle führt. Durch die Analyse der Morphologie dieses Dinoflagellaten konnte gezeigt werden, dass der Eintritt in die stationäre Phase mit dem Anstieg der Toxizität in engem Zusammenhang steht. Diese Ergebnisse wurden durch eine zweite Studie belegt, in welcher zusätzlich zu dem Isolat aus der Nordsee Spezies aus Japan und den USA untersucht wurden. In Verbindung mit der aufgestellten Hypothese, dass der Eintritt in die stationäre Phase bei den Plimitierten P. reticulatumKulturen zunächst lediglich zu einem Teilungsstopp der Kulturen ohne direkten Zelltod führt, kann geschlussfolgert werden, dass die Produktion der YTXs nicht durch die äußeren Einflüsse eingeschaltet wird, sondern in diesem Fall durch einen fortschreitenden Metabolismus in den Zellen bewirkt wird. Weiterhin konnte der Nachweis erbracht werden, dass die extrazelluläre Konzentration des YTX in der stationären Phase mit einer Zunahme des Zelltodes einhergeht und offensichtlich nicht durch eine gesteigerte Abgabe von YTX in das Kulturmedium verursacht wird.

Seit der Identifizierung von YTX wurden diverse YTXAnaloga im Phytoplankton und in Schalentieren detektiert, deren exakte Strukturen erst teilweise aufgeklärt werden konnten. Zunächst nahm man an, dass diese Analoga hauptsächlich durch Metabolisierung in Schalentieren entstehen. Mit der Entwicklung und dem Einsatz LCMS/MSbasierter Methoden zum Nachweis einzelner mariner Biotoxine und ihrer Strukturvarianten gelang es jedoch, diverse YTXs bereits im Phytoplankton nachzuweisen. Durch die Analyse von 18 P. reticulatumStämmen aus Japan, Neuseeland, Australien, den USA, Norwegen und Deutschland auf mehr als 20 YTXAnaloga konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Bildung der YTXs zwar vom Ursprungsort der Dinoflagellaten abhängt, jedoch im wesentlichen die gleichen YTXs produziert werden. Auch die detektierten Strukturvarianten der homo YTXReihe waren durch das Vorhandensein der YTXAnaloga mit typischen Modifikationen an der ungesättigten Seitenkette charakterisiert. Es wurden jedoch von einigen Stämmen charakteristische Toxine wie nor ring A YTX, methylierte YTXs oder die AmidAnaloga produziert. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die YTXAnaloga einen beträchtlichen Anteil ausmachen können. Der Anteil von 32Oarbinofuranosyl YTX, dessen Toxizität und Metabolismus bisher wenig untersucht ist, betrug bis zu 70 % des Gehaltes an GesamtYTXs.

Die gesetzlichen Regelungen im Hinblick auf YTXs sind in der EUVerordnung (EG) Nr. 853/2004 aufgeführt. Als StandardMethode wurde auch weiterhin der MBA vorgeschrieben, jedoch können weitere Verfahren wie funktionale und biochemische Tests sowie LCMS/MSMethoden ersatzweise oder zusätzlich angewandt werden. Diese Regelung wurde aufgrund der Schwierigkeiten eingeführt, welche sich aus den Nachteilen der einzelnen Analysenverfahren ergab. So ist vor allem die Anwendung des MBA neben der fehlenden Spezifität mit weiteren Nachteilen verbunden. Wegen der unterschiedlichen Toxizität der lipophilen marinen Biotoxine treten besonders im MBA nach der Extraktion, die zum Vorliegen aller lipophilen Substanzen im Rohextrakt führt, große Schwierigkeiten auf. Durch massenspektrometrische Verfahren kann bei Vorhandensein entsprechender Standardsubstanzen und genauerer Kenntnis bzgl. der Toxizität rechtlich relevanter ToxinAnaloga ein wirksamer Verbraucherschutz gewährleistet werden. Vor allem hinsichtlich der vielen Strukturvarianten von YTX spielt dies eine Rolle.

Derzeit sind lediglich vier der über 90 YTXAnaloga lebensmittelrechtlich geregelt, obwohl wenig über die Wirkungsweise und die Toxizität der anderen Strukturvarianten bekannt ist. Deshalb ist es notwendig zu untersuchen, ob - und wenn ja welche - YTXAnaloga durch Schalentiere vorrangig angereichert werden. Es zeigte sich, dass sowohl M. edulis als auch C. gigas YTXs akkumulieren. Der bereits publizierte Metabolismus von YTX durch M. edulis zu 45OH YTX, COOH YTX und 45OH COOH YTX konnte bestätigt und ergänzt werden, denn es gelang der Nachweis von zwei weiteren YTXAnaloga. In C. gigas konnten ebenfalls die OHund COOHDerivate detektiert werden, diese wurden jedoch nach der Beendigung der ToxinExposition relativ schnell abgebaut. C. gigas zeichnete sich aber überraschenderweise durch eine starke Akkumulation von keto YTX aus. Bisher ist nur wenig über die Toxizität der Strukturvarianten bekannt. Allerdings wird vermutet, dass die Verkürzung der Seitenkette zu einer Erniedrigung der Toxizität führt. Die derzeitige Überarbeitung der gesetzlichen Regelungen für marine Biotoxine ist folglich von großer Bedeutung, und es sollten, neben den bereits gesetzlich geregelten auch andere, häufig vorkommende YTXAnaloga einbezogen werden. Dadurch könnten wahrscheinlich auch die bestehenden Diskrepanzen zwischen biochemischen Tests (ELISA) und der Detektion mittels MS eingegrenzt werden. Außerdem sollten ToxizitätsäquivalenzFaktoren (TEF's) für häufig vorkommende YTXs etabliert werden, wie es für die Strukturvarianten anderer Toxingruppen bereits üblich ist.


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