Unsere Seite auf

Dissertationen
Linksammlung durchsuchen

 

Entwicklung von Fluoreszenzpolarisations-Sonden und afnitätsbasierten Photomarkierern für Sialyltransferasen sowie HT-Screening einer Sialyltransferase

Preidl, Johannes - Freie Universität Berlin (2011)


Die Fähigkeit zu metastasieren ist hauptursächlich für die hohe Letalität bösartiger Tumoren, während Primärtumoren bei rechtzeitiger Erkennung oft erfolgreich behandelt werden können. Zahlreiche unabhängige Studien zeigten einen Zusammenhang zwischen einer erhöhten Sialylierung von Zelloberächenmolekülen und der Invasions- und Metastasierungsfähigkeit von Tumorzellen. Außerdem besteht häug eine Korrelation zwischen einer erhöhten Expression von Sialyltransferasen und einer schlechten Prognose. Jedoch sind die zugrundeliegenden biomolekularen Mechanismen nur wenig erforscht, da es an Werkzeugen für in vivo Experimente mangelt.

In dieser Arbeit wurden hochaffine und reversibel bindende Fluoreszenzpolarisations-Sonden (FP-Sonde) für Sialyltransferasen entwickelt, indem ein Donorsubstrat-basierter übergangszustandsanaloger Inhibitor von Sialyltransferasen mit Fluorescein markiert wurde. Die Sonden wurden mit zwei Säugetier- (rST3Gal II und hST6Gal I) sowie zwei bakteriellen Sialyltransferasen (Pd2,6ST(N) und PmST1) getestet. Mit ihnen wurde der erste Fluoreszenzpolarisations-Assay (FP-Assay) für Sialyltransferasen etabliert, der Hochdurchsatz-fähig ist. Dies erlaubt das schnelle und einfache Testen von Inhibitoren gegen Sialyltransferasen und macht darüber hinaus Akzeptor- und Donorsubstrat überüssig.

Mit dem entwickelte Hochdurchsatz-FP-Assay (HT-FP-Assay) wurde erstmalig ein Hochdurchsatz-Screen (HTS, >100.000 Compounds/24 h) einer Sialyltransferase (rST3Gal II) gegen eine umfangreiche chemische Bibliothek, bestehend aus 28.864 Substanzen, durchgeführt. Der HT-FP-Assay erwies sich unter HTS-Bedingungen als überaus robust mit exzellenten Z-Werten (> 0.93). Die Validierung von 149 Primärhits ergab 11 Substanzen, die den Schwellenwert für die Aktivität und Reinheit erreichten und ein höheres Inhibitionspotential als Cytidindiphosphat aufwiesen. Sie stellen vielversprechende Leitstrukturen für die Entwicklung neuer Sialyltransferaseinhibitoren dar.

Durch Einbau einer photoreaktiven Benzophenongruppe in die FP-Sonden wurde ein Photoanitätsmarker entwickelt. Die Bestrahlung mit UV-Licht (~ 366 nm) erlaubte die affinitätsbasierte Markierung der beiden Säugetier- und der beiden bakteriellen Sialyltransferasen. Die Detektion der Markierungsprodukte in SDS-Gelen erfolgte durch Anregung des Fluoresceinrestes gefolgt von Fotographie. Erste Experimente, Volllängen-Sialyltransferasen auch in komplexen Proteomen zu markieren, waren vielversprechend.


—> Volltext

Abonnieren:

Empfehlen: