Untersuchung zu Struktur-Funktionsbeziehungen von Membranproteinen mittels Kraftspektroskopie
Oberbarnscheidt, Leoni - Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf (2010)
Membranproteine spielen eine wichtige Rolle zur Aufrechterhaltung vieler essentieller Bedingungen in der Zelle und ihre Struktur-Funktionsbeziehungen sind von großem Interesse um ihre Wirkungsweise zu verstehen. Mittels Rasterkraftspektroskopie lassen sich sowohl die inter- und intramolekularen Kräfte eines Proteins in der Membran, als auch die Bindungsraten von Rezeptor - Ligand Interaktionen bestimmen, so dass sie sich als geeignete Technik erweist, die gängigen strukturbiologischen Untersuchungen zu ergänzen.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde durch Entfaltungsexperimente an Sensorhodopsin II der Einfluss von Lichtaktivierung und Komplexbildung auf seine inter- und intramolekularen Kräfte untersucht. Hierzu wurde die Analysemethode zur Bestimmung der Stabilität einer Bindung oder Proteinregion weiter entwickelt. Ein Ansatz ist es, die Durchschnittskraft der Stabilität einer Proteinregion anzugeben, indem die Daten der Einzelmolekülmessung als Ensemble-Messung betrachtet werden. In einem anderen Ansatz wurde die Stabilität einer Proteinregion über die Abrisshäufigkeit einer Bindung in dieser Region bestimmt und die Auflösung der Histogramme erhöht. Beide Ansätze identifizieren Regionen, in denen sich die Stabilität in Abhängigkeit von Lichtaktivierung und Komplexbildung ändert, was dazu beiträgt, den Reaktionsmechanismus besser zu verstehen.
Um den Einfluss der Kraft auf das Energiepotential der Bindung zu berücksichtigen, wurde eine Analysemethode entwickelt, bei der die Dissoziationskonstante aus dem Verhältnis der Anzahl der Datenpunkte bei einer bestimmten Kraft zu der Anzahl der Abrisse bei dieser Kraft bestimmt werden kann.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden Rezeptor - Ligand Interaktionen gemessen, für die die Interaktionspartner gezielt an die Oberfläche gebunden wurden, um eine kontrollierte Interaktion zu messen. Zum einen wurde der Einfluss der Multivalenz auf den Ni-NTA-Histag Komplex untersucht. Der Vergleich des Tris-NTA/His6 Systems mit dem Mono-NTA/His2 System zeigt, dass die Affinität mit zunehmender Multivalenz deutlich ansteigt, aber die mechanische Stabilität beider Systeme gleich bleibt. Dies lässt sich auf die Geometrie des Komplexes zurückführen und trägt damit zum Verständnis multivalenter Bindungen bei. Des Weiteren wurde die Interaktion des Präpeptids des Lantibiotikums Nisin mit dem ABC-Exporter NisT, der Bestandteil der Modifizierungsmaschinerie zur Produktion von Nisin ist, untersucht. Fluoreszenzmessungen sowie Kraftspektroskopie zeigen spezifisches Binden des Präpeptids und erlauben somit Einblicke in die Interaktion.