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Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen von nichtribosomalen Peptidsynthetasen und Prenyltransferasen in der Biosynthese von Sekundärmetaboliten aus Ascomyceten

Mundt, Kathrin - Philipps-Universität Marburg (2013)


Im Laufe der Evolution, haben Mikroorganismen die Fähigkeit entwickelt, eine Vielzahl an strukturell vielseitigen und komplexen Substanzen zu bilden. Unter bestimmten Umweltbedingungen werden Biosynthesewege von komplexen Metaboliten induziert, die wiederum oft eine toxische Wirkung gegenüber den konkurrierenden Organismen zeigen. Vor Allem die Sekundärmetabolit-Produktion von filamentösen Pilzen stellt dabei eine wichtige Quelle von biologisch aktiven Stoffen dar, welche zum Nutzen der menschlichen Gesundheit eingesetzt werden können. Insbesondere die Enzymklassen der Polyketidsynthasen (PKS), nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) und NRPS/PKS-Hybride sind für die Synthese von neuen Naturstoffen verantwortlich, welche großes therapeutisches Potential (Antimykotika, Antibiotika, Immunsuppressiva) besitzen. Die metabolisierten Naturstoffe, können weiterführend durch z.B. Prenyltransferasen modifiziert und somit die Strukturvielfalt enorm gesteigert werden. Für die Entdeckung und Entwicklung neuer Arzneistoffe ist das Verstehen von Reaktionsmechanismen einzelner Enzyme in der Natur zwingend notwendig und dafür sind vor allem biochemische Untersuchungen von großer Bedeutung.

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden die Funktionen von zwei unbekannten Prenyltransferasen (FtmPT3, CdpC2PT) aus Neosartorya fischeri (N. fischeri) aufgeklärt. Das Gen ftmPT3, codiert für eine Prenyltransferase, welche in Anwesenheit von Dimethylallyldiphosphat (DMAPP) die Prenylierung von Verruculogen an OH-13 katalysiert und somit die lang gesuchte O-Prenyltransferase innerhalb der Fumitremorgin A-Biosynthese darstellt. Intensive Sequenzuntersuchungen zu ftmPT3 und der angrenzenden Nachbargene, wiesen im Vergleich zu Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) einen zusätzlichen Genbereich mit einer Größe von 9,6 kb und sieben Genen auf. Das Protein CdpC2PT, wies Sequenzidentitäten von 40 % mit der C2-Prenyltransferase BrePT aus Aspergillus versicolor und 42 % mit NotF aus Aspergillus sp. auf. Die Analyse der Reaktionsgemische von CdpC2PT mit DMAPP, zeigte die Akzeptanz zyklischer Dipeptide mit Substratpräferenz zu (S)-Benzodiazepindion und cyclo-L-Trp-L-Trp auf. Durch die Analyse der enzymatischen Produkte mittels NMR und MS, konnte CdpC2PT eindeutig als eine reverse C2-Prenyltransferase nachgewiesen werden, welche außerdem die Mono- und Di-Prenylierung von cyclo-L-Trp-L-Trp katalysiert. Literaturrecherche nach bekannten Naturstoffen wies die Existenz von mono- und diprenylierten cyclo-L-Trp-L-Trp Derivaten (Fellutaninen) in Penicillium fellutanum (P. fellutanum) nach und lässt folglich die Beteiligung von CdpC2PT in der Fellutanin-Biosynthese in N. fischeri vermuten. Die Sequenzanalyse der Nachbargene zeigte das Vorhandensein einer putativen Aminooxidase EAW25547 auf, welche in der Fellutanin-Biosynthese mitwirken könnte. Dieses Gen NFIA_043660 wurde aus der genomischen DNA (gDNA) von N. fischeri amplifiziert und in die beiden Expressionsvektoren pQE60 und pHIS8 kloniert. Nach der Untersuchung verschiedener Expressionsbedingungen konnte jedoch keine Proteinüberproduktion festgestellt werden.

Desweiteren wurde in der vorliegenden Arbeit, die letzte putative Prenyltransferase aus N. fischeri codierend durch NFIA_062330 untersucht. Sequenzanalysen ergaben ein orthologes Gen ACLA_042210 in Aspergillus clavatus (A. clavatus) mit einer 62 %igen Übereinstimmung auf Aminosäureebene. Die Gene ACLA_042210 und NFIA_062330 konnten jeweils aus gDNA amplifiziert und in den Expressionsvektor pQE60 kloniert werden. Die Überexpression der Gene wurde erfolgreich in dem für die Expression von pQE60-Konstrukten optimierten Stamm E. coli M15 [pREP4] durchgeführt. Für beide Enzyme wurde eine Vielzahl an diversen Substraten getestet, doch leider konnte bisher keine Aktivität nachgewiesen werden. Weiterhin wurden in dieser Arbeit die homologen NRPS-Gene Pc21g15480 aus Penicillium chrysogenum (P. chrysogenum) und NFIA_074300 aus N. fischeri in vivo funktionell untersucht. Beide Gene wurden erfolgreich aus gDNA amplifiziert und in den Expressionsvektor pJW24 überführt. Nach Protoplastierung und Transformation des Wildtyps Aspergillus nidulans (A. nidulans) TN02A7 mit den Expressionskonstrukten wurde die Integration der Gene für einige Transformanten mittels PCR-Screening nachgewiesen. Nach Extraktion der Kulturen der Pc21g15480-Transformanten konnte die deutliche Akkumulation zweier neuer Substanzen im Vergleich zum Wildtyp A. nidulans TN02A7 beobachtet werden. Nach Isolierung des ersten Produktes konnte mittels NMR- und MS-Analysen cyclo-L-Trp-L-His nachgewiesen werden. Die Untersuchung der NFIA_074300-Transformanten zeigte hingegen nur einen Transformanten mit einer zusätzlichen Produktbildung im Vergleich zu A. nidulans TN02A7 auf. Diese Substanz wurde mittels NMR und MS überraschenderweise als das PKS/NRPS-Produkt Pseurotin A identifiziert werden und stellte nicht die erwartete Substanz dar.

Ein weiteres Projekt beschäftigte sich mit der gezielten Koexpression der Prenyltransferasegene cdpC2PT oder cdpC3PT mit dem NRPS-Gen ftmPS aus N. fischeri. Die codierenden Gene NFIA_043650 und NFIA_074280 wurden nach der entsprechenden Amplifikation in das Expressionskonstrukt pCaW34 eingebracht. Nach der in vivo Synthese von cyclo-L-Trp-L-Pro (Brevianamid F) durch die NRPS FtmPS, wurden die Expressionskonstrukte in den Transformanten A. nidulans CaW03 (ftmPS) eingebracht. Die ektopische Integration der Gene wurde durch PCR-Screening der erhaltenen Transformanten bestätigt. Die Analyse der Sekundärstoffproduktion mittels HPLC zeigte, eine deutliche Produktbildung in den einzelnen Transformanten auf.


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