Biochemische und genetische Untersuchungen des Transkriptionsregulators Efg1 aus Candida albicans
Kurtz, Dagmar - Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf (2011)
APSES-Proteine sind "basic helix-loop-helix" (bHLH)-Transkriptionsfaktoren in Ascomyceten, die die Morphogenese zwischen kugelförmigen und filamentösen Zellformen regulieren. Der humanpathogene Pilz Candida albicans enthält mit Efg1 und Efh1 zwei zur Familie der APSES-Proteine gehörende Transkriptionsfaktoren. Die molekularen Mechanismen der Zielgenerkennung und die posttranslationalen Modifikationen von APSESProteinen sind noch weitgehend unklar. Das Efg1-Protein wurde als Fusionsprotein mit einem N-terminalen Dekahistidin-Epitop heterolog in Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae und homolog in C. albicans produziert und durch Metallaffinitätschromatographie aufgereinigt. Das aus E. coli isolierte Efg1-Protein wurde erfolgreich zur Herstellung eines polyklonalen Anti-Efg1-Antiserums in Kaninchen eingesetzt. Das Anti-Efg1-Antiserum eignete sich zur Identifikation von Efg1 in C. albicans Rohextrakten und zur Immunpräzipitation von Efg1. Mit Hilfe von deletierten Efg1-Varianten konnte gezeigt werden, dass das Anti-Efg1-Antiserum mit mehreren Efg1-Epitopen interagiert.
In Immunoblot-Analysen konnte Efg1, das aus S. cerevisiae und C. albicans isoliert worden war, als Dreifachbande mit molekularen Massen von 75, 83 und 88 kDa detektiert werden. Behandlung mit Lambda-Proteinphosphatase führte zum Abbau der 88 und 83 kDa Proteine zugunsten des 75 kDa Proteins. Da aus E. coli isoliertes Efg1 eine molekulare Masse von 75 kDa aufweist, kann angenommen werden, dass die 83 und 88 kDa Varianten auf Phosphorylierungen zurückzuführen sind, wobei das 83 kDa-Phosphoprotein die Hauptform von Efg1 darstellt. Analyse des Phosphorylierungszustands von deletierten Efg1 Varianten zeigte, dass lediglich die Deletion der konservierten APSES/bHLH Domäne zu einem Verlust der Phosphorylierung führte. Zudem konnte im zeitlichen Verlauf nach Hypheninduktion eine Änderung des Efg1-Phosphorylierungsmusters im Immunoblot festgestellt werden, wobei die 88 kDa Form ab- und die 83 kDa Form zunahm. Die Efg1-Phosphorylierung erfolgt unerwarteterweise nicht durch Proteinkinase A (PKA), da tpk1 und tpk2 Mutanten ein unverändertes Efg1 Phosphorylierungsmuster zeigten. Das Efg1 Phosphorylierungsmuster veränderte sich ebenfalls nicht bei hypoxischem Wachstum, obwohl Efg1 unter diesen Bedingungen als Repressor und nicht als Aktivator wirkt.
Transkriptionsfaktoren des bHLH-Typs bilden typischerweise Homo- oder Heterodimere, die für Efh1, aber nicht für Efg1 durch Zweihybriduntersuchungen bisher nachgewiesen wurden. Durch Gelfiltrationschromatographie wurde die molekulare Masse von gereinigtem Efg1 aus E. coli und aus C. albicans mit ca. 180 kDa bestimmt, die einem Homodi- oder -trimer entspricht. Spontane Homodimerisierung ist vermutlich die Voraussetzung für die DNA-Bindung von gereinigtem Efg1, die durch Verzögerungsgele mit einem EFG1 Promotorfragment nachgewiesen wurde. Die erhaltenen Ergebnisse bilden die Voraussetzung für weiterführende Arbeiten zur Klärung der Phosphorylierungsstellen von Efg1, der beteiligten Kinasen und der dreidimensionalen Struktur von Efg1.