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Analyse des Amyloid-Beta Peptids mit superauflösender optischer Mikroskopie

Kempis, Pia - Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf (2013)


Die Alzheimersche Demenz ist eine bisher unheilbare neurodegenerative Erkrankung. Sie führt zu Gedächtnisverlust, Störungen der motorischen Fähigkeiten, Wesensveränderungen und schließlich zum Tod des Patienten. Im Verlauf der Krankheit reichern sich im Gehirn der Patienten schädliche Stoffwechselprodukte an, die das Nervengewebe irreversibel schädigen. Das Amyloid-β-Peptid (Aβ) ist hierbei von zentraler Bedeutung. Durch Aggregation kann es verschiedene lösliche und unlösliche Formen wie Oligomere, Fibrillen oder Plaques bilden. Es wird angenommen, dass die löslichen Aβ-Oligomere die bedeutendste neurotoxische Wirkung zeigen und somit zum krankheitsauslösenden Schritt führen. Eine eindeutige Diagnose der AD ist nur post mortem möglich. Eine Diagnose pre mortem basiert neben neurologischen und kognitiven Tests auf bildgebenden Verfahren. Ein wesentlicher Nachteil aller bildgebenden Verfahren, bei denen Licht zur Detektion eingesetzt wird, ist die Beugungsbegrenzung. Aufgrund der Beugungsbegrenzung erscheinen alle Objekte, die lateral kleiner als etwa 200 nm sind, als verschmiertes Objekt. Sowohl Größe als auch Form können nicht mehr eindeutig bestimmt werden. Die für AD als krankheitsauslösend angenommenen Aβ-Oligomere können detulich kleiner als 200 nm sein. Zur detaillierten Untersuchung der Aβ-Oligomere wurden zwei superauflösende optische Mikroskopiemethoden (PAINT und dSTORM) getestet. Ein schon existierendes Protokoll zur Immobilisierung und Detektion von Aβ- Aggregaten wurde an die Anforderungen der superauflösenden Mikroskopie angepasst. Außerdem wurden weitere experimentelle Bedingungen etabliert, die es ermöglichen superaufgelöste Bilder von Aβ-Aggregaten bzw. Aβ-Oligomeren zu erzeugen.

Es konnten superaufgelöste Bilder von immobiliserten Aβ-Aggregaten und Aβ-Oligomeren unter Anwendung der dSTORM-Technik hergestellt werden. Im Vergleich zu beugungsbegrenzten Weitfeldbildern konnten nach der superaufgelösten Rekonstruktion der Bilder deutlich mehr - insbesondere kleine- Aβ-Aggregate bzw. Aβ-Oligomere sichtbar gemacht werden. Durch zweifarbige dSTORM-Analysen von Aβ-Aggregaten, die mit unterschiedlichen fluoreszenzmarkierten Antikörpern versehen wurden, konnte eine hohe Spezifität zur Selektion von Aβ-Aggregaten erreicht werden. Es wurde gezeigt, dass co-aggregierte Aβ-Aggregate aus zwei Aβ-Spezies (Aβ 1-40 und Aβ 1-42) immer in beiden Farben detektiert werden können, wenn jede Spezies mit einem unterschiedlich markierten spezifischen Antikörper versehen wurde. dSTORM-Messungen von menschlichen AD-Proben haben ergeben, dass die darin enthaltenen Aβ-Aggregate aus Aβ 1-40 und Aβ 1-42 aufgebaut sind. Zukünftig sollen Studien zum Mengenverhältnis der verschiedenen Aβ-Spezies in Aβ-Aggregaten angefertigt werden.


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