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Multiparameter-Fluoreszenz-Image-Spektroskopie von Proteinkomplexen in planta

Grabowski, Stephanie - Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf (2014)


Die Multiparameter-Fluoreszenz-Image-Spektroskopie (MFIS) vereinigt folgende Fluoreszenz-Mikroskopie-Methoden: Fluoreszenz-Lebensdauer-Mikroskopie (FLIM) und Fluoreszenz-Anisotropie-Mikroskopie (FAIM), mit denen molekulare Komplexbildung über Förster Resonanzenergietransfer (FRET) nachwiesen werden können, sowie Methoden der kinetischen Mikroskopie wie Fluoreszenzerholung nach Photobleichen (FRAP) und Fluoreszenz- Korrelations-Spektoskopie (FCS), mit denen Moleküldynamiken gemessen werden können.

In dieser Arbeit wurde erstmalig das volle Potential von MFIS in lebenden Zellen genutzt und die Interaktion der Rezeptorkinasen ACR4 und CLV1, denen eine zentrale Rolle bei der Stammzellenregulation in der Wurzel von Arabidopsis thaliana zukommt, auf molekularer Ebene in planta untersucht. Das simultane Auslesen mehrerer Fluoreszenz-Parameter und die damit verbundene Verknüpfung von Informationen erlaubte die umfassende Untersuchung der molekularen Interaktionen von ACR4 und CLV1, die sowohl Komplexbildung als auch die molekularen Dynamiken umfasst. Komplexbildung von Rezeptorkinasen mit Korezeptoren und Proteinen in der Plasmamembran stellt ein grundlegendes Element der ligandeninduzierten Signaltransduktion dar.

In dieser Arbeit wurde sowohl die heteromere als auch homomere Komplexbildung von ACR4 und CLV1 nachgewiesen, die in Fusion mit den fluoreszenten Proteinen GFP und mCherry in Blattepidermiszellen in Nicotiana benthamiana transient exprimiert wurden. FRET-FLIM-Messungen ergaben, dass ACR4 und CLV1 an der Plasmamembran miteinander heteromere Komplexe und jeweils homomere Komplexe bilden. Durch die quantitative Analyse von FRET und die intensitätsbasierte Bestimmung der Molekülkonzentrationen konnte die Gleichgewichtskonstante der Komplexbildung abgeschätzt werden.

Die homomere Komplexbildung von ACR4 wurde in stationären und zeitaufgelösten Fluoreszenz-Anisotropie-Messungen über Homo-FRET nachgewiesen. Der kombinierte pixelweise Nachweis von Hetero-FRET über die Fluoreszenz-Lebensdauer und von Homo-FRET über die stationäre Fluoreszenz-Anisotropie in MFIS-Bildern ermöglichte eine Analyse mit hoher räumlicher Auflösung. Auf diese Weise konnten gezielt kleine Kanäle in der Plasmamembran, sogenannte Plasmodesmata (PD), untersucht werden, die bei maximaler Auflösung nur wenige Pixel in einem MFIS-Bild umfassen. Es konnte gezeigt werden, dass an PD eine verstärkte Bildung sowohl von heteromeren Komplexen von ACR4 und CLV1 als auch von homomeren ACR4-Komplexen stattfindet.


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