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Lokalisation und Quantifizierung der Aufnahme von Nanokristallen in der Leber

Bargheer, Denise - Universität Hamburg (2014)


In dieser Arbeit wurde mithilfe einer postsynthetischen Radiomarkierung von cadmiumbasierten Quantum Dots (QDs) mit 65Zn und von superparamagnetischen Eisenoxid-Nanokristallen (SPIOs) mit 51Cr die Bioverteilung dieser polymerumhüllten Partikel in Mäusen nach i.v. Injektion untersucht. Eine postsynthetische Radiomarkierung der äußersten ZnS-Schale von QDs mit 65Zn resultierte in einem labilen Label, das bei der ultraschallgesteuerten Polymerverpackung zum Teil verloren ging. Es konnte dennoch dazu genutzt werden, Grundzüge der Bioverteilung von polymerumhüllten QDs zu untersuchen. Die QDs reicherten sich in kurzer Zeit vorrangig in der Leber an. In einem Zeitraum von vier Wochen kam es zu einer Umverteilung der 65Zn-Aktivität, die auf eine partielle Degradation der QDs zurückzuführen war.

Im Gegensatz zu den 65Zn-markierten QDs, zeigten die mit 51Cr radiomarkierten SPIOs ein stabiles Label. Analog zu den QDs erlaubte dieses die Verfolgung der Kurzzeitverteilung der SPIOs und wies eine Anreicherung in der Leber nach. Anders als die Zinkaktivität retinierte die 51Cr-Aktivität über einen Zeitraum von vier Wochen weitestgehend in der Leber, obwohl die Partikel schon größtenteils degradiert waren, wie bereits frühere Studien gezeigt haben. Diese Ergebnisse sprechen gegen einen spezifischen Export von dreiwertigen Cr-Ionen aus Leberzellen, was nach bisherigen Modellen physiologisch möglich sein müsste. Sie unterstützen daher die These, dass Chrom kein essentielles Spurenelement ist, obwohl dies in der Literatur seit nun mehr 50 Jahren diskutiert wird.

Von bisherigen Studien war bekannt, dass die hier verwendeten polymerverpackten Nanopartikel nach i.v. Injektion im Wesentlichen vom Mononukleären Phagozyten System der Leber, also von Kupffer-Zellen (KC) und sinusoidalen Endothelzellen (LSEC), aufgenommen werden. In verschiedenen Experimenten wurde nun versucht, die Verteilung zu quantifizieren und zusätzlich die Rolle von Hepatozyten an der direkten Nanopartikel-Aufnahme genauer zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit beschreibt erstmalig eine Methode, bei der primäre murine Leberzellen, welche SPIOs aus einer i.v. Injektion aufgenommen haben, mithilfe einer Säule in einem Magnetfeld isoliert werden können. Immunzytochemische Färbungen sowie Analysen mittels Durchflusszytometrie zeigten, dass KC und LSEC die Partikel zu fast gleichen Teilen aufnehmen. Ein vergleichbares Bild ergab sich bei mikroskopischen Untersuchungen von murinen Lebergewebsproben nach Injektion von polymerumhüllten QDs. Eine direkte Nanopartikel-Aufnahme in Hepatozyten konnte in vivo nicht beobachtet werden, obwohl diese Zellen aufgrund der Partikelgröße theoretisch direkt erreicht werden könnten. Wurden hingegen primäre Hepatozyten 2 h nach Injektion von 59Fe-markierten SPIOs präpariert, war Aktivität in den Zellen zu finden. Unter Berücksichtigung der übrigen Befunde, wurde dieses Ergebnis als rasche Zulieferung von freigesetztem Eisen aus metabolisierten SPIOs aus anderen Leberzellen gewertet.

In weiteren Versuchen wurde die Möglichkeit untersucht, ob durch Kopplung von Proteinen an die Nanopartikel ein aktives Umlenken der Nanopartikel in Hepatozyten hinein ermöglicht werden kann. Als Ligand wurde Transferrin ausgewählt, dessen hohe Affinität für Hepatozyten in vivo weitläufig bekannt ist. Sowohl in Zellkultur als auch in vivo konnte jedoch keine verstärkte Aufnahme von entsprechenden Nanopartikel-Konstrukten in Hepatozyten gefunden werden. Eine mögliche Erklärung ist, dass das Protein für das spezifische Targeting in vivo durch die rasche Bildung einer Proteinkorona maskiert wird und deshalb nicht mehr von den Zellen erkannt werden kann.

In Studien mit 59Fe-markierten SPIOs und daran gebundenem, 125I-markiertem, murinen Transferrin wurde der Einfluss der Proteinkorona-Bildung auf die Aufnahme in Leberzellen von Mäusen in vivo direkt untersucht. Dabei wurden Nanopartikel-Konstrukte mit kovalent gebundenem 125I-Transferrin mit Konstrukten verglichen, an welche Transferrin nur adsorbiert war. In beiden Fällen fand sich kein Unterschied in der Verteilung der Label und Transferrin wurde wie der Partikel selbst rasch aus dem Plasma entfernt und von der Leber aufgenommen. Dies zeigte, dass die rasche Korona-Bildung in vivo die Transferrin Moleküle zwar nicht von der Partikeloberfläche verdrängt, sehr wohl aber in der Lage zu sein scheint, sie zu maskieren.

Ein Ansatz für ein spezifisches Targeting gelang schließlich mit der Wahl einer anderen Hülle. Wurden Nanopartikel in rekombinante Lipoproteinmizellen eingebettet und die Mäuse vor i.v. Injektion einer Kälteaktivierung unterzogen, konnten höhere Aktivitäten in Hepatozyten verzeichnet werden, welche auf eine direkte Partikelaufnahme zurückgeführt wurden.

Die Arbeit liefert einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des Verhaltens von Nanokristallen in einer biologischen Umgebung (in vitro und in vivo).


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