Identifizierung und Interpretation von Wirkstoffmetaboliten in der systematischen toxikologischen Analyse unter Verwendung der HPLC mit Photodiodenarray-Detektor (HPLC-DAD) und der Flüssigchromatographie mit Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-TOF-MS)
Bakdash, Abdulsallam - Freie Universität Berlin (2010)
Metabolite spielen bei der analytischen Aufklärung und der Interpretation von Medikamentvergiftungen eine große Rolle. Daher wurde in dieser Dissertation unter dem besonderen methodischen Aspekt der HPLC mit Photodiodenarray-Detektor (HPLC-DAD) und der Flüssigchromatographie mit Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-TOF-MS) systematisch untersucht, in welchem Maße eine Identifizierung von Metaboliten in der Praxis der systematischen toxikologischen Analyse von Todesfällen möglich ist.
Im theoretischen Teil der Arbeit wurden zunächst die Grundlagen der Metabolisierung von Wirkstoffen im menschlichen Organismus dargestellt, die physikalisch-chemischen Prinzipien der angewendeten Methoden auch unter dem speziellen Aspekt des Nachweises von Metaboliten behandelt und die Fachliteratur zum Thema zusammengefasst, wobei der Schwerpunkt auf der relativ neuen LC-TOF-MS-Methode lag.
Als wesentliches Probenmaterial wurde in dieser Arbeit Blut herangezogen, das allgemein die größte Bedeutung in der toxikologischen Analyse besitzt und durch Extraktion mit Dichlormethan im basischen und sauren Bereich aufgearbeitet wurde. Hierdurch wurden stark hydrophile Metabolite wie Glucuronide nicht erfasst. In wenigen Fällen wurden auch Urin und Leberproben analysiert. Für die HPLC-DAD-Messungen wurden Anlagen der Firma Shimadzu verwendet. Die Detektion erfolgte zwischen 195-380 nm mit einem Acetonitril/Phosphatpuffergemisch (pH=2,3) an RP8-Säulen.
Es wurden zwei verschiedene LC-TOF-MS Geräte der Firmen Agilent und Waters mit einer Massengenauigkeit < 5 ppm verwendet. Für ergänzende Untersuchungen stand ein LC-QTOF-MS-Instrument der Firma Agilent zur Verfügung. Die Chromatographie erfolgte an einem Gradienten mit Fließmittel aus Methanol und wässriger Ameisensäure an einer C18 Säule. Die in-source ESI-CID Spektren wurden bei zwei unterschiedlichen Kollisionsenergien aufgenommen. Mit niedriger Energie wurden Spektren ohne Fragmentierung erhalten und mit hoher Energie mit Fragmentierung. Das Q-TOF/MS Instrument ermöglichte die Messungen der Massenspektren im MS sowie im MS-MS Modus.
Insgesamt wurden Proben von 430 Todessfällen mit 47 Wirkstoffen analysiert, wobei diese Wirkstoffe mit einer Häufigkeit zwischen 1 und 90 in den Fällen vorkamen. Durch HPLC-DAD wurden von insgesamt 141 Metaboliten die UV-Spektren gemessen und die korrigierten relativen Retentionszeiten sowie die auf die Muttersubstanz bezogenen Retentionszeiten (QRRT-Werte) der Metabolite bestimmt. Durch LC-TOF/MS wurden insgesamt für 406 Metabolite die MS- und die MS-MS-Spektren gemessen und die relative Retentionszeit bestimmt.
Von den 47 Wirkstoffen wurden in der schriftlichen Arbeit die Ergebnisse für die sechs Substanzen Amprenavir, Citalopram, Clozapin, Diphenhydramin, Flecainid und Ketamin ausführlich dargestellt. Ausgehend von den aus der Literatur bekannten Metabolisierungsschemata wurden zunächst die Ionenchromatogramme der Metabolite in den LC-TOF-MS- (bzw. den LC-QTOF-MS)-Files gesucht und mit Hilfe der exakten Massendifferenz konkreten Metabolisierungsprozessen (Desalkylierungen, Hydroxylierungen usw.) zugeordnet. Eine genauere Strukturzuordnung, insbesondere die Unterscheidung isomerer Metabolite wurde auf der Basis der Fragmentspektren versucht, die durch kollisionsinduzierte Dissoziation in der Ionenquelle (in-source CID) bei einstufigen Geräten oder in der Kollisionzelle des Q-TOF-Instrumentes erfolgte. Eine entscheidende Hilfe war dabei die Interpretation des Fragemtierungsverhalten der Metabolite im Vergleich zur Muttersubstanz. Alle Metabolite wurden durch Massenspektrum und Fragmentierungs-schemata eindeutig beschrieben.
Als Kriterien der Zuordnung von chromatographischen Peaks zu bestimmten Metaboliten wurden das regelmäßige Auftreten bei Vergiftungen mit dem Ausgangwirkstoff, die charakteristische aus der Strukturänderung resultierende Retentionzeitverschiebungen gegenüber dem Ausgangwirkstoff, die mit LC-TOF/MS bestimmten akkuraten Molmassen mit der Massengenauigkeit des Precursers <5ppm und die Übereinstimmung des Isotopenverhältnisses von >90% sowie die Zuordnung der Hauptfragmente des MS-MS-Experiments herangezogen. Bei HPLC-DAD wurden die Identität oder die Ähnlichkeit der UV-Spektren mit dem Muttersubstanz, die relative Retentionszeit RT und der Retentionszeitquotient QRRT von Metabolit und Wirkstoff benutzt. Für die Zuordnung der Metabolite im HPLC-DAD-Chromatogramm wurde zusätzlich ein Vergleich mit dem LC-TOF-MS-Ergebnissen vorgenommen.
Bei den beispielhaft beschriebenen Vergiftungsfällen zu diesen sech Wirkstoffen, besonders ausführlich für Diphenhydramin, wurde eine halbquantitative Bestimmung der Metaboliten-konzentrartionen vorgenommen und das Konzentrationsverhältnisses CMet/CWirkst,berechnet. Dieses Verhältnis wurde mit Angaben aus der Vorgeschichte und zum Zeitverlauf der Intoxikationen verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass die auf den Ausgangwirkstoff bezogene Metabolitenkonzentration unter bestimmten Bedingungen eine Abschätzung der Überlebenszeit nach der Giftaufnahme gestattet.
Für acht weitere Wirkstoffe (Amitriptylin, Levomeprazin, Mirtazapin, Quetiapin, Saquinavir, Sertralin, Venlafaxin, Verapamil) konnte im Rahmen dieser Arbeit lediglich ein kurzer Überblick über die festgestellten Metabolite ohne ausführliche Interpretation der Spektren gegeben werden. Schließlich wurden in einem zusammenfassenden Abschnitt auf der Basis der bei einzelnen Wirkstoffen festgestellten Ergebnisse die Kriterien für die Erkennung und Charakterisierung der Metaboliten mittels LC-TOF/MS im Vergleich zu den HPLC-DAD Ergebnissen für Desalkylierungen, oxidative Desaminierungen, Hydroxylierungen, Epoxidierungen, Oxidationen am Stickstoff und Schwefel sowie Dehalogenierungen diskutiert. Insgesamt führten die Untersuchungen zu dem Schluss, dass LC-TOF-MS und HPLC-DAD, insbesondere auch in Kombination, geeignete Methoden darstellen, die eine sichere Zuordnung von Metaboliten in der systematischen toxikologischen Analyse auch ohne Referenzsubstanzen gestatten. Die in den Fallproben mit beiden Methoden gemessenen und strukturell zugeordneten Spektren können in einer Datenbank als Vergleich für die Peakidentifikation in der Routine der toxikologischen Analyse dienen.