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11.06.2013

Neue Sonde zur Markierung von Biomolekülen


Amerikanische Forscher haben eine Sonde zur Markierung von Biomolekülen entwickelt, deren Fluoreszenz erst "angeknipst" wird, wenn sie gebunden wird. Wie sie in der Zeitschrift Angewandte Chemie berichten, erfolgt die Reaktion sehr rasch, und der Helligkeitsunterschied zwischen "An-" und "Aus-"Zustand ist um zwei Größenordnungen größer als bei herkömmlichen aktivierbaren Sonden.

Biomoleküle in lebenden Zellen mit fluoreszierenden Sonden zu markieren, ist ein gängiges Verfahren. Neue Möglichkeiten eröffnen sich durch eine Kombination mit so genannten bioorthogonalen Reaktionen. Darunter versteht man Reaktionen, die in einem lebenden System stattfinden können, ohne die normalen biochemischen Prozesse zu stören. So lassen sich z.B. "anknipsbare" Sonden generieren: Ein bioorthogonaler Bindungspartner wird an das interessierende Biomolekül gebunden (ohne es zu beeinträchtigen) und stellt dann die Verankerungsstelle für die Fluoreszenzsonde dar. Die Sonde ist so konzipiert, dass ihre Fluoreszenz deutlich verstärkt wird, wenn sie an die Verankerungsstelle bindet. Da nicht an das Ziel gebundene Sonden weit weniger stark fluoreszieren, wird die Hintergrundfluoreszenz verringert. Aufwendige Waschschritte, die die Beobachtung der Zellen verzögern, werden überflüssig.

Damit das gut klappt, muss das System ohne toxischen Katalysator auskommen, rasch reagieren, um eine zeitliche Auflösung von biologischen Vorgängen zu ermöglichen, und nach dem "Anknipsen" sehr stark fluoreszieren, um das Signal gegenüber dem Hintergrund zu maximieren. All diese Forderungen konnten bisher nicht gleichzeitig erfüllt werden. Das Team vom Massachusetts General Hospital und der Harvard University um Ralph Weissleder hat nun ein System entwickelt, das diese Lücke schließt: ein außergewöhnlich helles, schnell reagierendes, biokompatibles Sondensystem mit hoher Differenz zwischen aus- und angeknipstem Zustand.

Die neuen Sonden bestehen aus zwei Komponenten: Baustein 1 ist ein Fluoreszenzfarbstoff namens BODIPY (Bordipyrromethen), ein System aus drei Ringen mit einer Baugruppe aus einem Bor-, zwei Stickstoff- und zwei Fluoratomen. Baustein 2 ist ein Tetrazin-Molekül, ein Sechsring aus vier Stickstoff- und zwei Kohlenstoffatomen. Tetrazin löscht die Fluoreszenz von BODIPY aus: BODIPY gibt die eingestrahlte Energie strahlungslos an den Tetrazin-Baustein ab, statt sie als Fluoreszenz abzustrahlen. Tetrazin dient gleichzeitig als Reagenz für die bioorthogonale Reaktion.

Als Reaktionspartner verwenden die Forscher ein modifiziertes trans-Cycloocten (TCO), das zuvor über einen Antikörper an das interessierende Biomolekül gekuppelt wird. Gibt man nun die Sonde zu, bindet das Tetrazin das TCO unter Abspaltung von Stickstoff, die Sonde wird so an das Biomolekül geknüpft. Durch die Reaktion wird die Tetrazin-Gruppierung der Sonde zerstört - die Fluoreszenzlöschung wird aufgehoben, der BODIPY-Molekülteil leuchtet nun intensiv grün. Die Forscher konnten eine mehr als tausendmal stärkere Fluoreszenz als im ausgeknipsten Zustand verzeichnen. Das ist um zwei Größenordnungen stärker als bei allen bisherigen anschaltbaren Sonden.

Erfolgsgeheimnis ist die besonders starke Fluoreszenzlöschung, die durch eine spezielle elektronische Konstellation und räumliche Anordnung der beiden Bausteine BODIPY und Tetrazin zueinander ermöglicht wird.

—> Originalpublikation

Quelle: Angewandte Chemie




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