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08.07.2011

Neues statistisches Verfahren zur Analyse von ELISAs


Der häusliche Schwangerschaftstest ist der bekannteste, aber es gibt sie noch für viele andere Zwecke: Tests, die auf der Bindung zwischen Antikörpern und Antigenen beruhen. Diese Bindungen funktionieren nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip und werden für immunologische Tests ausgenutzt, um kleinste Stoffkonzentrationen zu bestimmen. Zum Beispiel können mit ELISAs (Enzyme-Linked Immunosorbent Assays) sehr spezifisch und sehr empfindlich Antikörper erkannt werden, die der Körper bildet, um Viren oder Bakterien zu bekämpfen. Ein Problem bei der Auswertung von ELISAs ist nicht nur die Schätzung der Konzentration, sondern auch die Angabe der dazugehörigen Messunsicherheit. Jetzt ist in der Physikalisch-Technischen Bundesanstalt (PTB) ein statistisches Verfahren entwickelt worden, das die Auswertung deutlich zuverlässiger macht. Entwickelt am Beispiel eines Tests auf Interferon, lässt es sich generell für Konzentrationsbestimmungen durch ELISAs anwenden. Das Verfahren ist in der aktuellen Ausgabe der Zeitschrift Clinical Chemistry and Laboratory Medicine veröffentlicht.

Immunoassays sind biochemische Tests, die die hohe Spezifität von Antikörper-Antigen-Bindungen ausnutzen und damit zur Bestimmung kleinster Stoffkonzentrationen in komplexen Medien eingesetzt werden können. Diese Tests werden vielseitig angewendet, beispielsweise für den Nachweis von Infektionen, Hormonen oder Drogen. Ein solcher Immunoassay ist der sogenannte Sandwich-ELISA, ein enzymgekoppelter Immunadsorptionstest, der den Nachweis von Antigenen durch deren Bindung an zwei Antikörper ermöglicht. Dabei wird ein Antikörper an ein Enzym gekoppelt, um ein nachweisbares Signal (wie z. B. Fluoreszenz) zu erzeugen.

Bei fluoreszenzbasierten Sandwich-ELISAs wird die Konzentration einer Lösung aus einer Reihe von Fluoreszenzmessungen geschätzt, die durch chemische Behandlung der mehrfach verdünnten Originallösung generiert werden. Um die Beziehung zwischen Konzentration und Fluoreszenzmessung besser bestimmen zu können, wird für jedes ELISA eine Kalibration durchgeführt, d. h. dieselben Protokollschritte werden zusätzlich mit einer Lösung bekannter Interferon-Konzentration durchgeführt.

Diese Beziehung zwischen Konzentration und Fluoreszenzintensität kann mithilfe eines statistischen Modells beschrieben werden (durch ein nichtlineares Modell mit variablem Gauß'schen Fehlerterm). Die Abschätzung dieses Modells, also die Kalibrierung, und dessen Anwendung für die Bestimmung der unbekannten Konzentration ist statistisch eine anspruchsvolle Aufgabe, wie eine aktuelle internationale Vergleichsstudie verdeutlicht. In dieser Studie bestimmten einige Labore durchschnittliche Konzentrationen, die doppelt so hoch waren wie die anderer Labore. Die angegebenen Messunsicherheiten dieser Konzentrationsschätzungen decken diese gravierenden Unterschiede bei Weitem nicht ab.

In der PTB wurde ein neues statistisches Verfahren zur Analyse von ELISAs entwickelt. Dieses Verfahren nutzt den Bayes"schen Ansatz und kombiniert somit in kohärenter Weise die Kalibration des Modells und die Bestimmung der unbekannten Stoffkonzentration. Dies führt zu vertrauenswürdigen Unsicherheitsintervallen für Schätzwerte. Darüber hinaus ermöglicht der Bayes'sche Ansatz die Berücksichtigung von Vorwissen (durch Formalisierung als Wahrscheinlichkeitsverteilung) und die unabhängige Analyse jedes einzelnen Datensatzes.

Das entwickelte statistische Verfahren ist allgemein anwendbar zur Konzentrationsschätzung durch ELISAs. Als Fallstudie wurden die Messdaten der oben erwähnten internationalen Vergleichsstudie erneut ausgewertet. Im Ergebnis wurden korrigierte Konzentrationswerte und realistischere Messunsicherheiten erzielt, und im Gegensatz zur ursprünglich vorgeschlagenen Datenanalyse konnte eine weitgehende Konsistenz der experimentellen Methoden verifiziert werden. Mit dem neuen statistischen Auswerteverfahren ist es nun möglich, die Messdaten von fluoreszenzbasierten ELISAs zuverlässig zu evaluieren und damit auch die Konzentration von Interferon IFN α-2b verlässlich zu bestimmen.

Quelle: idw/Physikalisch-Technische Bundesanstalt (PTB)




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