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08.10.2002

Hochsensitiver Protein-Test entwickelt


Einzelne Moleküle sichtbar zu machen ist heute keine Utopie mehr. Optische Verfahren auf Basis der Fluoreszenzspektroskopie erlauben es bereits, Dynamik und Wechselwirkungen winzigster Substanzmengen in Lösung, aber auch in lebenden Zellen zu untersuchen. Wissenschaftlern um Petra Schwille am Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie in Göttingen ist es jetzt gelungen, eine derartige Methode so zu verfeinern, dass bereits geringste Mengen von Biomolekülen, in diesem speziellen Fall Enzyme, auf ihre funktionalen Eigenschaften analysiert werden können (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, PNAS, 17. Dezember 2002). Damit ist der Wunsch vieler Forscher, die Interaktionen einzelner Moleküle in lebenden Zellen direkt beobachten zu können, in greifbare Nähe gerückt.

Fluoreszenzspektroskopische Verfahren zur Charakterisierung der physikalisch-chemischen Eigenschaften einzelner Moleküle haben inzwischen weite Verbreitung gefunden - dank leistungsstarker Laser und hochempfindlicher Detektoren einerseits sowie geeigneter Fluoreszenz-Farbstoffe andererseits. In der biochemischen und molekularbiologischen Forschung geht es heute darum, die Dynamik von Proteinen und Nukleinsäuren - möglichst auf der Ebene einzelner Moleküle - zu untersuchen. Auf der Wunschliste ganz oben steht bei den Wissenschaftlern seit langem die Möglichkeit, molekulare Wechselwirkungen in der lebenden Zelle verfolgen zu können.

Eine Göttinger Wissenschaftlergruppe hat jetzt unter Leitung von Dr. Petra Schwille einen neuen fluoreszenzbasierten Enzym-Test, ein so genanntes Protease-Assay, vorgestellt. Dieser Test erlaubt es, enzymatische Abbaureaktionen in Echtzeit bei minimalsten Enzym- und Substratkonzentrationen in Größenordnungen von wenigen Mikro- und Nanomol pro Liter zu analysieren. Ein Mol ist die Stoffmenge einer Substanz, die aus ebenso vielen Teilen besteht, wie 0,012 kg des Nuklids Kohlenstoff-12 (12C) Atome enthält; ein Mikromol entspricht einem Millionstel, ein Nanomol einem Milliardstel Mol.

Die Grundidee für den neuen Test besteht darin, Eiweißbruchstücke (Peptide) an ihren beiden Enden mit zwei spektral verschiedenen Farbstoffen zu markieren. Dafür benutzten die Max-Planck-Forscher klonierbare Farbstoffe, so genannte "fluoreszente Proteine" - eine Mutante des GFP-Proteins im grünen und das nah verwandte Protein DsRed im roten Spektralbereich. Diese Farbstoffe haben den großen Vorteil, dass auf ihnen beruhende Test-Assays auch für intrazelluläre Messungen verwendet werden können, ohne dass man das markierte Substrat nachträglich in die Zelle einschleusen muss.

Die durch das Enzym zerschnittenen und die ungeschnittenen Substratmoleküle kann man zunächst - makroskopisch - aufgrund der enzymatisch bedingten Änderung des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) zwischen den beiden Farbstoffen unterscheiden. Dieser Energietransfer basiert darauf, dass bei großer räumlicher Nähe der beiden Farbstoffe - typischerweise im Bereich unterhalb von 60 Angström - ein strahlungsloser Energietransfer zwischen dem direkt angeregten grünen und dem nicht direkt angeregten roten Farbstoff erfolgt. Der Abstand zwischen beiden Markierungen wird im Emissionssignal farblich kodiert: Grüne Emission steht für großen und rote Emission für kleinen Abstand. Werden also die Peptide in zwei Fragmente zerlegt, tritt auch eine räumliche Trennung der Farbstoffe ein, was zu einer Abnahme des Energietransfers (FRET) führt. Die Peptidlösung ändert also unter Bestrahlung ihre "Farbe" bzw. ihr Fluoreszenzspektrum.

Quelle: Max-Planck-Gesellschaft




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