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Nachrichten und Pressemeldungen aus Labor und Analytik

26.09.2002

Validierung von Prüfverfahren für Arzneimittel


Wer Arzneimittel analysieren möchte, muß sich dazu validierter Analysenverfahren bedienen, oder diese selber validieren. Diese recht weitgreifende Forderung bezieht sich nicht nur auf neue Methoden, sondern auch auf jegliche Änderungen oder Abwandlungen, die der Analysierende an amtlich validierten Prüfverfahren vornimmt. Noch verschärfter stellt sich die Situation bei Fertigarzneimitteln dar. Hier muß auf Grund der besonderen Matrices und verschiedenen Herstellungsverfahren für jedes Produkt eine Validierung der Analysenverfahren vorgenommen werden.

Regeln zur Validierung

Die Anlayse von Arzneimitteln erfordert gemäß § 6 der Pharmabetriebsverordnung validierte Prüfverfahren. Dort heißt es: "Die zur Prüfung angewandten Verfahren sind nach dem jeweiligen Stand der Wissenschaft und Technik zu validieren." Diese recht allgemeine Angabe wird durch die Erläuterungen zum Antrag auf Zulassung eines Arzneimittels vom 31.10.1996 durch das Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte spezifiziert. Weitere Hinweise zur Validierung geben die beiden Regelwerke "ICH Harmonised Tripartite Guideline" des CPMC mit den Titeln "Validation of Methods: Definitions and Terminology" und "Analytical Note for Guidance on Validation of analytical Procedures: Methodology (1995)".

Prinzipiell findet man sich in der pharmazeutischen Analytik vor die Aufgabe gestellt, sowohl Arzneimittelausgangsstoffe (arzneilich wirksame Bestandteile, Konservierungsstoffe, Farbstoffe und sogenannte sonstige Bestandteile), als auch fertige Arzneimittel zu prüfen. Zur Analyse von Arzneimittelausgangsstoffen sind die meisten Prüfverfahren und Spezifikationen in Arzneibüchern wie DAB, Ph.Eur. USP oder BP beschrieben, so daß hier keine neue Methodenentwicklung notwendig ist. Bei der Anwendung dieser amtlich validierten Prüfverfahren ist zunächst auch keine Revalidierung erforderlich. Wird aber das Verfahren vom Analytiker geändert oder erweitert, muss neu validiert werden.

Bei Fertigarzneimitteln steht man vor einer völlig anderen Situation. Durch die unterschiedliche Matrix und differierende Herstellungsverfahren wird auch bei identischer Wirkstoffzusammensetzung eine Validierung für jedes Produkt erforderlich. Im Gegensatz zur Umwelt- und Wasseranalytik hat die pharmazeutische Analyse jedoch den Vorteil, dass sie vorwiegend gezielt auf bekannte Wirksubstanzen, Konservierungsstoffe und Verunreinigungen prüft und die Matrix bekannt ist.

Welche speziellen Prüfungen werden an Fertigarzneimitteln durchgeführt?

Man unterscheidet bei der Prüfung von Fertigarzneimitteln zwischen Chargenkontrollen als Voraussetzung für die Freigabe eines Arzneimittels und Stabilitätsprüfungen, die die Haltbarkeitsdauer des Arzneimittels bestimmen. Die zu prüfenden Parameter sind weitgehend identisch. Bei Stabilitätsprüfungen ist die Prüfung auf Zersetzungsprodukte zusätzlich erforderlich. Typische Prüfparameter sind:

  • Allgemeine und spezielle Merkmale der Darreichungsform wie Aussehen, Farbe, Masse, Zerfallszeit bei Tabletten
  • Identitätsprüfung von Wirksubstanzen, Konservierungsmitteln, Farbstoffen, Antioxidatien etc.
  • Gehaltsbestimmung von Wirksubstanzen usw.
  • Reinheitsprüfungen auf z.B. Zersetzungs-, Umwandlungsprodukte, Restlösemittel, mikrobiologische Reinheit
  • Wirkstofffreisetzung

Wie erfolgt die Validierung der einzelnen Prüfverfahren?

Die allgemeinen und die speziellen Merkmale der Darreichungsform werden nach Standardprüfverfahren der Arzneibücher geprüft und müssen bei strikter Einhaltung der Prüfverfahren nicht validiert werden. Prüfverfahren zur Identitätsprüfung müssen hinsichtlich ihrer Spezifität überprüft werden. Wenn ein Prüfverfahren nicht sehr spezifisch ist, müssen zwei oder mehrere Prüfverfahren kombiniert werden. Es sollte eine wissenschaftliche Betrachtung vorgenommen werden, um zu klären, welche Interferenzen möglich sind. Chromatographische Prüfverfahren in der Pharma-Analytik werden, wie auch in anderen analytischen Bereichen, auf folgende Eigenschaften überprüft:

  • Spezifität
  • Linearität
  • Messbereich
  • Richtigkeit
  • Präzision
  • Nachweisgrenze
  • Bestimmungsgrenze
  • Robustheit

Die Note of Guidance on Validation of Analytical Procedures: Methodology CPMP/ICH/281/95 beschreibt detailliert, wie man hierbei vorgehen soll und welche Datenmenge erforderlich ist. Typische Anforderungen werden nachfolgend beschrieben.

Spezifität

Bei chromatographischen Prüfverfahren sind Chromatogramme, die die Spezifität demonstrieren, vorzulegen. Für kritische chromatographische Trennungen ist darüber hinaus ein Trennfaktor zu spezifizieren, der dann als Qualitätskriterium für Routineprüfungen gilt. Prüfverfahren zur Gehalts- und Reinheitsprüfung müssen so beschaffen sein, dass Verunreinigungen sowohl von der Matrix als auch von anderen Komponenten abgetrennt sind und dass die Matrix keinen Einfluss auf die Quantifizierung hat.Stehen keine Standards von Verunreinigungen und Zersetzungsprodukten zur Verfügung oder wird auf unbekannte Verunreinigungen geprüft, kann die Spezifität durch Anwendung zweier unterschiedlicher Prüfver-fahren zur Ermittlung des selben Parameters nachgewiesen werden. Die Spezifität von Reinheitsprüfverfahren wird durch Vergleich von Verunreinigungsprofilen überprüft. Allgemein gilt die Spezifität als nachgewiesen, wenn Anzahl und Größe der Peaks bei beiden Prüfverfahren übereinstimmen. Die zweite Prüfmethode, Referenzprüfverfahren, soll zum einen gut charakterisiert sein, z.B. eine Arzneibuchmethode oder ein anderes validiertes Prüfverfahren, und zum anderen unabhängig vom ersten sein. Durch Stresstests werden die für die Prüfsubstanz typischen Zersetzungsprodukte hergestellt und nachempfunden (Licht, Hitze, Feuchte, Säure-/Basehydrolyse oder Oxidation).

Die Spezifität des Gehaltsprüfverfahrens wird durch Vergleich der beiden Prüfverfahren bestimmt. Die Spezifität gilt als nachgewiesen, wenn die beiden Prüfverfahren zum gleichen Ergebnis kommen. Die Peakreinheit kann alternativ durch Diodenarray oder Massenspektroskopie nachgewiesen werden.

Linearität

Die Linearität sollte über den ganzen Meßbereich nachgewiesen werden. Mindestens fünf verschiedene Konzentrationen müssen dabei untersucht werden. Der Nachweis der Linearität erfolgt über eine graphische Auswertung mit Angabe der Regressionsfunktion und dem Korrelationskoeffizienten. Von nicht linearen Bezugskurven ist die Kalibrierfunktion anzugeben.

Messbereich

Der spezifizierte Messbereich wird in der Regel von Linearitätsstudien abgeleitet und hängt zudem von der beabsichtigten Anwendung ab. Er gilt als validiert, wenn das Prüfverfahren in dem für die spezielle Anwendung interessierenden Bereich linear, präzise und richtig ist. Je nach Prüfparameter sind mindestens folgende Messbereiche zu betrachten:

  • Gehaltsbestimmungen 80 bis 120% der zu bestimmenden Substanz
  • Gleichförmigkeit des Gehaltes 70 bis 130% der deklarierten Wirkstoffmenge
  • Wirkstofffreisetzung ± 20% der Spezifikation oder bei kontrollierter Freisetzung ± 20% der spezifizierten Wirkstoffabgabemenge (z.B. 0-110%, wenn spezifiziert ist 20% nach einer Stunde bis 90% nach 24 Stunden)
  • Reinheitsprüfungen von der erwarteten bis zu 120% der maximal erlaubten Konzentration
  • Bei Reinheitsprüfungen auf toxische Verunreinigungen muß der Nachweis erbracht werden, daß die Nachweis/-Bestimmungsgrenze ausreicht, um die Verunreinigungen mit genügender Sicherheit in der zu prüfenden Konzentration zu bestimmen.

Richtigkeit

Die Richtigkeit des Verfahrens muss über den ganzen Meßbereich nachgewiesen werden. Für Prüfverfahren zur quantitativen Bestimmung von Verunreinigungen in Ausgangsstoffen oder Fertigarzneimitteln sowie zur Gehaltsbestimmung von deklarierten Bestandteilen in Fertigarzneimitteln wird zum Nachweis der Richtigkeit vorzugsweise die Wiederfindungsrate nach definiertem Zusetzen der Prüfsubstanz ins Placebo herangezogen.

Dabei sollen mindestens 9 Bestimmungen mit drei unterschiedlichen Konzentrationen, die im spezifischen Bereich liegen, vorgenommen werden (3x80%, 3x100% und 3x120%). Auch durch Vergleich mit einem zweiten, vom ersten unabhängigen, validierten Prüfverfahren kann die Richtigkeit einer Methode nachgewiesen werden (Methodenvergleich).

Präzision

Die Präzision ist ausgehend von derselben homogenen Probe (z.B. Mischmuster) zu belegen. Sie kann entweder durch mindestens 9 Bestimmungen mit drei unterschiedlichen Konzentrationen im spezifischen Bereich oder durch sechsfache Bestimmung bei 100% der Konzentration des Prüfverfahrens bestimmt werden. Die alleinige Ermittlung der Gerätepräzision ist nicht ausreichend. In welcher Form die "Intermediate Precision" überprüft werden muß, hängt vom Anwender ab. Er sollte Einflüsse auf die Präzision des Prüfverfahrens, die durch Randeffekte wie unterschiedliche Laboratorien, Apparaturen oder Analysenzeitpunkte hervorgerufen werden können, abklären. Für die durchgeführten Mehrfachbestimmungen sind ferner der Mittelwert, die Standardabweichung, die relative Standardabweichung und der Vertrauensbereich anzugeben.

Nachweisgrenze

Die Nachweisgrenze des Prüfverfahrens kann entweder über das Signalrauschverhältnis (3:1 oder 2:1) oder mittels der Standardabweichung des Responsfaktors und des Anstieges der Regressionsgeraden ermittelt werden. Dabei gilt:

DL=3.3 x s/S
DL= Nachweisgrenze (Detection-Limit)
s= Standardabweichung
S= Anstieg der Kalibriergeraden

Die Standardabweichung der Peaksignale kann entweder durch Messungen des größten Rauschens von mehreren Blind- oder Placebolösungen oder durch eine spezifische Kalibriergerade für die Prüfsubstanzen mit Konzentrationen in der Nähe der Nachweisgrenze bestimmt werden.

Bestimmungsgrenze

Die Bestimmungsgrenze QL kann bestimmt werden:

  • durch das Signalrauschverhältnis von Proben mit bekannter Konzentration an Prüfsubstanz mit Blind-/Placebolösungen. Ein typisches Signalrauschverhältnis ist 10:1
  • oder
  • basierend auf der Standardabweichung des Peaksignals und dem Anstieg der Regressionsgeraden, wobei die Bestimmungsgrenze QL folgendermaßen berechnet werden kann:
    QL = 10 x s/S<
    QL= Bestimmungsgrenze (Quantitation-Limit)
    s= Standardabweichung der Peakantwort
    S= Anstieg der Kalibrierkurve

Robustheit

Die Robustheit ist ein Maß für die Güte eines Verfahrens in Bezug auf geringe Veränderungen an der Methode. Dazu misst man die "system suitability-Parameter" wie Auflösung oder Trennfaktor bei Änderungen wie

  • zeitliche Stabilität der Lösung
  • Extraktionszeit
  • Einfluss bei geringen Eluentenveränderungen
  • verschiedene Säulenchargen
  • Temperatur
  • Flussrate

Ausblick

Die Validierung von Prüfverfahren in der Pharma-Analytik umfasst die Überprüfung von Spezifität, Messbereich, Linearität, Richtigkeit, Präzision, Nachweisgrenze, Bestimmungsgrenze und Robustheit. Es werden vorwiegend Identitäts-, Gehaltsbestimmungs- und Reinheitsprüfverfahren validiert. Physikalische Eigenschaften und andere Prüfparameter werden meist nach bereits validierten Prüfverfahren der amtlichen Arzneibücher geprüft. Besonders gründlich muss die Validierung von Prüfverfahren, auf Zersetzungsprodukte, die während der Lagerung der Arzneimittel entstehen können, vorgenommen werden. Dies ist dann besonders schwierig, wenn die möglichen Zersetzungsprodukte nicht bekannt sind. Hierzu wäre es sehr hilfreich, wenn in Zukunft ein Guideline genauere Validierungsanleitung geben würde.

Quelle: Liebich Laboratorium


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