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   Kurze Einführung zum Thema Chromatographie


Ziel: Auftrennung der einzelnen Bestandteile eines Substanzgemisches.

Prinzip: Unterschiedliche zeitliche Verzögerung (Retention) der einzelnen Analyten durch unterschiedlich starke Wechselwirkungen mit dem chromatographischen System, das aus einer stationären Phase und einer mobilen Phase besteht.

Aufgabe der stationären Phase:
Wechselwirkungen mit den Bestandteilen der Probe (Analyten)

Aufgabe der mobilen Phase:
Transport (in Gaschromatographie und Flüssigkeitschromatographie)
Beeinflussung der Wechselwirkungen der Analyten mit der stationären Phase (in der Flüssigkeitschromatographie).

Art der Wechselwirkungen mit der stationären Phase: Adsorption und/oder Verteilung

Adsorption: Anlagern von Teilchen an eine feste Oberfläche an der Phasengrenzfläche zu einer gasförmigen oder einer flüssigen Phase. Der entgegengesetzte Vorgang ist die Desorption, d.h. das Freisetzen adsorbierter Teilchen in die andere Phase. Die Stärke der Adsorption ist u.a. abhängig von der Art der stationären Phase, der Art der Probenkomponenten und der Temperatur.

Verteilung: Aufenthalt von Teilchen in zwei benachbarten, nicht mischbaren Phasen bzw. Übergang einer Substanz zwischen den Phasen. Der Grad der Verteilung ist u.a. abhängig von der Art der Substanz, den beteiligten Phasen und der Temperatur.

Die Natur ist immer bestrebt, einen Gleichgewichtszustand zwischen der Anzahl Teilchen in den beiden angrenzenden Phasen zu erreichen. Ist das Gleichgewicht einmal eingestellt, bleibt das System aber nicht „stehen“, sondern es findet weiterhin Adsorption und Desorption sowie Verteilung statt, aber es werden pro Zeiteinheit gleich viele Teilchen adsorbiert wie desorbiert bzw. bei der Verteilung gehen gleich viele Teilchen in die eine Phase über wie zurück in die andere Phase gehen. Und ganz wichtig: die Lage des Gleichgewichtes ist auch abhängig von der Temperatur.

Mit steigender Temperatur werden alle Prozesse in der Natur beschleunigt (RGT-Regel), d.h. je höher die Temperatur, desto schneller geht die Desorption und umso schneller erfolgt bei der Verteilung der Übergang einer Substanz in die benachbarte flüssige oder gasförmige Phase.

Besonderheit bei der Chromatographie: die Trennung soll ja in möglichst kurzer Zeit erfolgen, deshalb kann die Einstellung und Aufrechterhaltung eines Gleichgewichtszustands nicht das Ziel sein. Hier kommt die mobile Phase ins Spiel: sie stört permanent die Einstellung der Gleichgewichte, in dem sie die Analyten weitertransportiert (GC, LC) bzw. selbst um die Plätze an der Oberfläche der stationären Phase konkurriert (LC).

Insgesamt kann man sich die stationäre Phase als eine Ansammlung von "Andockplätzen" vorstellen, die die Analyten nacheinander ansteuern. "Andocken" - wechselwirken - weiter transportiert werden - am nächsten Platz "andocken" - wechselwirken usw. Je mehr "Andockplätze" vorhanden sind, desto mehr Wechselwirkungen können erfolgen und um so stärker werden die Analyten retardiert (verzögert).

Verschiedene Arten der Chromatographie:
Gaschromatographie
Flüssigkeitschromatographie


Gaschromatographie
(engl. Gas Chromatography, GC)

Voraussetzung: Die Analyten sind unzersetzt verdampfbar

Mobile Phase: gasförmig = Trägergas (Carrier)
- dient lediglich zum Transport der Analyten und beeinflusst die Selektivität des Systems nicht.
- Typische Trägergase: Helium, Wasserstoff, Stickstoff

Stationäre Phase: fest oder flüssig
- befindet sich in der sog. GC-Säule, bestimmt die Selektivität des Systems

GC-Säulen: gepackte Säulen (engl. packed columns) oder Kapillarsäulen (engl. Capillary columns)

Gepackte Säulen:
- stationäre Phase in Form von festen Partikeln (z.B. 80-100 mesh)
- gepackt in eine Glas- oder (meist) Edelstahlröhre
- Außendurchmesser (engl. OD) z.B. ¼“ oder 1/8“
- Länge z.B. 1-3 Meter.
- Vorteile: robust, günstig, geeignet für einfache Trennprobleme
- Nachteile: breite Peaks, schlechte Trenneffizienz

Kapillarsäulen:
- offene "Röhren"
- Innendurchmesser (ID) z.B. 0,1 bis 0,53 mm
- Länge z.B. 10-100 Meter
- die stationäre Phase befindet sich als Schicht einer gewissen Dicke auf die Innenseite der Kapillaren
- Vorteile: schmale Peaks, hohe Trenneffizienz, geeignet für komplexe Trennprobleme
- Nachteile: bei viel schmutziger Matrix besteht die Gefahr der schnellen Kontamination

Feste stationäre Phase: Gas Solid Chromatography, GSC
- anorganische Adsorbentien (z.B. Molsieb (engl. Molsieve), Kieselgel, Aluminiumoxid, Kohlenstoff) oder organische Polymere (basierend auf Polystyroldivinylbenzol, z.B. Hayesep, Porapak)
- als gepackte Säule oder als Kapillarsäule (PLOT-Säule, engl. Porous Layer Open Tubular, als Partikel oder als feste Schicht auf der Innenseite der Kapillare)
- Trennprinzip: Adsorption, Beschleunigung der Desorption durch Temperaturerhöhung
- Anwendungsbereich: Gasanalytik, sehr leicht flüchtige Substanzen

Flüssige stationäre Phase: Gas Liquid Chromatography, GLC
- am weitesten verbreitet
- hoch siedende Polymere: Polysiloxane oder Polyethylenglykole
- als gepackte Säule: ein festes Trägermaterial (engl. Support, z.B. Chromosorb) wird mit der flüssigen stationären Phase beschichtet
- als Kapillarsäule (WCOT-Säule, = engl. Wall Coated Open Tubular): die Flüssigkeit wird als dünner Film auf die Innenwand der Kapillare aufgebracht
- Trennprinzip: Verteilung zwischen Flüssigkeit und Gasphase, Beschleunigung des Übergangs in die mobile Phase durch Temperaturerhöhung
- Anwendungsbereich: unzersetzt verdampfbare Substanzen mit Siedepunkten bis ca. 350°C (unter gewissen Voraussetzungen auch höher)

Flüssigkeitschromatographie (engl. Liquid Chromatography, LC)

Stationäre Phase: fest

Mobile Phase (Laufmittel, Eluent): flüssig

Verschiedene Arten: z.B. HPLC (Hochdruckflüssigkeitschromatographie, engl. High Pressure Liquid Chromatography bzw. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, engl. High Performance Liquid Chromatography), DC (Dünnschichtchromatographie, engl. Thin Layer Chromatography, TLC)


HPLC

zunächst Hochdruckflüssigkeitschromatographie genannt (engl. High Pressure Liquid Chromatography), später zur Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (engl. High Performance Liquid Chromatography) "befördert"

Mobile Phase: flüssig, auch Eluent genannt
- wird unter Hochdruck durch die HPLC-Säule gepumpt
- Transportiert die Analyten von "Andockplatz" zu "Andockplatz"
- beeinflusst gleichzeitig die Wechselwirkungen zwischen Analyt und stationärer Phase (Konkurrenz), d.h. bestimmt zusammen mit der stationären Phase die Selektivität des Systems.
- die Probe muss vollständig darin gelöst sein
- die stationäre Phase muss vollständig durch die Mobile Phase benetzt sein
- Art der mobilen Phase abhängig vom Phasensystem (NP oder RP, siehe unten)

Stationäre Phase: fest
- feine Teilchen, meist 3-5 µm Partikelgröße
- dicht gepackt in eine dünne Edelstahlröhre (Innendurchmesser meist 2 - 4,6mm)
- Trennprinzip: sowohl Adsorption als auch Verteilung
- Beschleunigung der Elution primär durch Erhöhung der Elutionsstärke der mobilen Phase. (Erhöhung der Temperatur trägt ebenfalls zur beschleunigten Elution bei.)- Zwei verschiedenen Arten von Phasensystemen: NP und RP


Normalphasenchromatographie
(NP, engl. Normal Phase Chromatography):

stationäre Phase polar: Kieselgel oder Aluminiumoxid

mobile Phase unpolar (z.B. Heptan, Hexan, Chloroform, Ethylacetat)

Elution durch Zugabe polarer Lösemittel (z.B. Dioxan, THF, Isopropanol, Ethanol)

Anwendungsbereich: Substanzen, die im unpolaren Eluenten löslich sind und Wechselwirkungen mit der polaren stationären Phase eingehen können, insbesondere Isomerentrennungen, präparative HPLC


Umkehrphasenchromatographie
(RP, engl. Reversed Phase Chromatography).

stationäre Phase unpolar: Kieselgel unpolar modifiziert (z.B. mit C18-Ketten, C8, Phenyl usw.) oder Polymermaterial (z.B. Polystyroldivinylbenzol, PSDVB)

mobile Phase polar (z.B. Wasser, Puffer, Gemische mit Methanol, Acetonitril oder THF)

Elution durch Erhöhung des Anteils an Methanol, Acetonitril oder THF

Anwendungsbereich: Substanzen, die im polaren Eluenten löslich sind und Wechselwirkungen mit der unpolaren stationären Phase eingehen können.

DC (Dünnschichtchromatographie, engl. Thin Layer Chromatography, TLC)

Mobile Phase: flüssig, vergleichbar mit der HPLC

Stationäre Phase: fest, von der Art her vergleichbar mit der HPLC, aber sie befindet sich nicht in einer Säule, sondern ist auf eine Trägerplatte (z.B. Papier oder Glas) aufgebracht.

Trennprinzip: wie in der HPLC, Adsorption und Verteilung

Vorgehensweise: Die Trägerplatte taucht am unteren Rand ein wenig in den Eluenten (Laufmittel) ein. Dieser befindet sich meist am Boden einer Glaskammer (ggf. mit Deckel) oder eines einfachen, ggf. verschließbaren Glases. Die Probe wird zuvor direkt auf die trockene Platte aufgetragen, und zwar so, dass sie sich ein Stück über der Lösemitteloberfläche befindet. Der Transport des Laufmittels über die Platte nach oben erfolgt durch Kapillarkräfte, wobei die Probe transportiert und durch Wechselwirkungen mit der stationären Phase und dem Eluenten in ihre Einzelbestandteile aufgetrennt wird.

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