26.04.2018
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Ein zellbasierter Biolumineszenzassay zur Untersuchung der Dimerisierung und Aggregation des Prionproteins

Wüsten, Katharina Annick - Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn (2017)


Prionenerkrankungen wie z. B. die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit bei Menschen oder die Bovine Spongiforme Encephalopathie (BSE) bei Rindern gehören zu den neurodegenerativen Erkrankungen. Grundlage aller Prionen-Krankheiten ist das zelluläre Prion-Protein (PrPC) und die infektiöse Isoform PrPSc, die im Gegensatz zu PrPC vermehrt β-Faltblattstrukturen und Aggregate formt. Es gibt Hinweise darauf, dass PrPC Dimere bilden kann und diese eine Grundlage fur die Entstehung von PrPSc-Aggregaten sein könnten. Um die Dimerisierung von PrP zu untersuchen, wurden zwei Fusionsprodukte aus PrP mit der N- bzw. C-terminalen Hälfte von Gaussia Luziferase kloniert, die an der Oberfläche von RK13 Zellen exprimiert wurden. Dimerisierte PrPC an der Oberfläche von transfizierten RK13 Zellen, komplementierten sich beide Luziferasehälften und wurden biolumineszent. Die Dimerisierung von PrPC konnte mit Antikörpern, die gegen die zentrale Region von PrPC gerichtet waren blockiert werden. Dies zeigte, dass die zentrale Region für die Dimerisierung von PrPC eine wichtige Rolle spielte. Eine Infektion der RK13-Zellen mit Hirnhomogenat erkrankter Mäuse, die sechs verschiedene mausadaptierte Prionstämme beinhalteten, führte zu einem Anstieg des Biolumineszenzsignals, während Hirnhomogenat gesunder Tiere keine Auswirkungen auf das Biolumineszenzsignal hatte. Die Behandlung mit dem Antiprion-Wirkstoff Quinacrine führte nur bei den infizierten Zellen zu einer Reduktion des Biolumineszenzsignals.

Darüberhinaus wurde die Biolumineszenzuntersuchung dazu genutzt, Wirkstoffe zu identifizieren, die gegen Prionen wirksam sein könnten. Dazu wurde eine Sammlung von 1650 Wirkstoffen verwendet. Wirkstoffe, die ohne toxisch zu sein, die Dimerisierung von PrPC inhibierten, wurden an prioninfizierten N2a-Zellen auf ihre Wirksamkeit untersucht, diese Zellen von PrPSc zu bereinigen. Dabei wurde der Wirkstoff JTC-801 identifiziert, der bereits in nanomolaren Konzentrationen die PrPSc-Menge in den infizierten Zellen senken konnte.

Die mithilfe der Biolumineszenzuntersuchung erhobenen Ergebnisse zeigten, dass das entwickelte und etablierte zellbasierte Testverfahren eine vielseitige Methode ist, um wichtige Aspekte der Prion Biologie zu erforschen.


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