Analytik NEWS
Das Online-Labormagazin
29.03.2024
Glossar durchsuchen

Linksammlung durchsuchen

Untersuchungen zur Bestimmung des inhärenten katalytischen Potentials von Metall-bindenden Enzymen

Wetzl, Dennis - Universität Stuttgart (2014)


In der hier vorgestellten Arbeit sollte, beispielhaft an zwei Modell-Systemen, untersucht werden ob und inwieweit man das katalytische Potential von Metalloenzymen nutzen kann, um alternative, sogenannte promiskuitive Reaktionen zu katalysieren. Dabei teilten sich die beiden Modell-Systeme, die Eisen-bindende Taurin Dioxygenase (TauD) und die artifizielle Kupfer-bindenen tHisF Varianten, eine HisHisAsp Triade als gemeinsames Strukturmotiv für die Koordination der Metallionen Eisen bzw. Kupfer. Es konnte gezeigt werden, dass die natürliche Hydroxylierungsreaktion der TauD genutzt werden kann, um Carbonsäuren, die strukturell ähnlich zu den natürlichen Substraten sind, in a-Position zu den entsprechenden a-Hydroxy-Carbonsäuren zu hydroxylieren. Dabei verlief die Hydroxylierung im Falle des Modellsubstrats b-Alanin mit guter Enantioselektivität zur Bildung von D-Isoserin mit einem ee-Wert von 96 % bei einem mäßigen Umsatz von 22,6 ± 0,7 %. Weiterhin konnten analoge w-Aminocarbonsäuren der Kettenlänge C4 - C6 mit dem TauD Wildtyp umgesetzt werden, wobei diese sowohl in Umsatz als auch ee-Werten der entsprechenden Produkte deutlich unter denen des b-Alanins lagen. Anhand Struktur-basierter Untersuchungen konnte eine Variante der TauD erstellt werden, welche sowohl in Bezug auf Umsätze (Steigerung des Umsatzes von b-Alanin von 22,6 ± 0,7 auf 54,2 ± 3,8 %) als auch Enantioselektivitäten (10 ± 1 % auf > 96 % bei g-Aminobuttersäure) bezüglich der getesteten Substrate signifikant verbesserte Eigenschaften gegenüber dem Wildtyp aufwies. Die Untersuchungen zur katalytischen Promiskuität zeigten, dass während TauD zur Katalyse alternativer Reaktionen wenig geeignet war und keine bzw. nur geringe Umsätze bezüglich der getesteten Modellreaktionen zeigte, tHisF mit zwei getesteten Modellreaktionen (der Michael-Addition und der Aldolreaktion) Umsetzungen zeigte. Jedoch konnte in weiterführenden Untersuchungen gezeigt werden, dass das artifizielle Metallzentrum der tHisF nicht an der Katalyse der entsprechenden Reaktionen beteiligt ist. So konnte im Falle der Michael-Addition gezeigt werden, dass die Reaktion weitgehend ohne Beteiligung des Enzyms sowie ohne Beteiligung des entsprechenden Metalls ablief. Die Aldolreaktion hingegen wird, analog zu entsprechenden Organokatalysatoren, von Lysin-Aminosäure-Seitenketten der tHisF katalysiert, welche sich an der Oberfläche des Enzyms befinden. Dies konnte anhand von Experimenten mit verschiedenen Varianten der tHisF, bei denen unterschiedliche mögliche reaktive Zentren per Mutagenese ausgeschaltet wurden, ermittelt werden.


» Volltext