Methoden zum Nachweis von Allergenen im Wein
Wessels, Hauke Tjard - Universität Hamburg (2017)
Potentiell allergene Proteine aus Hühnerei oder auch aus boviner Milch können für sensitive Verbraucher ein Problem darstellen. Da im Rahmen der Weinproduktion Proteine wie Lysozym aus Hühnerei zur Kontrolle der malolaktischen Gärung oder Ovalbumin beziehungsweise Casein zur Schönung eingesetzt werden, können Rückstände auch im Lebensmittel Wein verbleiben. Die Nutzung von Antikörpern für analytische Zwecke ermöglicht aufgrund der hohen Affinität und Spezifität der Bindung zum entsprechenden Antigen auch den Nachweis von Allergenspuren. Da die Produktion dieser Immunoglobuline jedoch stets Tiere beziehungsweise tierabhängige Methoden beinhaltet und gemäß der aktuellen Gesetzgebung der Einsatz von Tieren für wissenschaftliche Zwecke reduziert werden soll, wurden in der vorliegenden Arbeit Alternativen entwickelt.
Da in den etablierten Methoden der entsprechende Antikörper lediglich einmal eingesetzt werden kann, wurde zur Reduktion des Verbrauches zunächst ein wiederverwendbares System auf Antikörperbasis entwickelt. Durch den Einsatz der Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie und Entwicklung einer Regenerationsprozedur ohne Beeinträchtigung der biologischen Aktivität konnte ein wiederverwendbarer Biosensor zur Detektion von Lysozym und Ovalbumin in Weißwein entwickelt werden. Die gesetzlich vorgeschriebenen Anforderungen (0,25 ppm Nachweisgrenze; 0,5 ppm Bestimmungsgrenze) sind durch eine direkte Messung von Proben und entsprechenden Kalibrierstandards innerhalb kürzester Zeit mit minimalem Personalaufwand realisierbar.
Um eine vollständige Unabhängigkeit von Antikörpern zu erreichen, wurden auch die Einsatzmöglichkeiten von Aptameren zur Detektion von Allergenen im Kontext Wein untersucht. Diese einzelsträngigen Nukleinsäuren sind aufgrund des fehlenden Komplementärstrangs in der Lage mit unterschiedlichsten Zielmolekülen zu interagieren und werden durch einen Selektionsprozess vollständig in vitro generiert. Unter Nutzung eines teilautomatisierten Selektionsprozesses konnten in der vorliegenden Arbeit mehrere potentielle Sequenzen mit einer Affinität gegenüber Lysozym, Ovalbumin und den bovinen Caseinen identifiziert und in der Folge charakterisiert werden. Unter Berücksichtigung der nanomolaren Dissoziationskonstanten der Aptamer-Target-Komplexe wurden zunächst in Analogie zu den antikörperbasierten Biosensoren entsprechende Aptameranaloga entwickelt. Es zeigte sich bei der Analyse unterschiedlicher Proben, dass die Lysozym- und Ovalbuminaptamere zwar keine absolute Spezifität aufweisen und der Selektionsprozess diesbezüglich optimiert werden sollte, jedoch eine Detektion in Puffer und Realproben möglich ist.
Die im Vergleich mit den Antikörpern hohe Stabilität der Nukleinsäuren gegenüber äußeren Einflüssen legt einen Einsatz in Vor-Ort-Methoden wie beispielsweise in LFDs (engl.: lateral flow devices) nahe. Unter Verwendung der selektierten Aptamere mit einer hohen Affinität zu Lysozym konnten entsprechende Systeme entwickelt und zur Detektion in Wein eingesetzt werden, um so beispielsweise die Einhaltung des gesetzlich vorgeschriebenen Höchstwertes (500 ppm) zu überprüfen. Des Weiteren wurden die genannten Aptamere genutzt, um eine bisher nicht in der Literatur beschriebene Möglichkeit der spezifischen Detektion nach einer HPTLC-Trennung (engl.: high performance thin layer chromatography) zu etablieren. Die Detektion unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Aptameren konnte auf unterschiedlichen stationären Phasen erfolgreich durchgeführt werden. Das entwickelte System konnte zur Untersuchung von Realproben und auch zur Beurteilung der Spezifität der Lysozym- und Caseinaptamere genutzt werden, wobei sich zeigte, dass die Lysozymaptamere in diesem Kontext eine hohe Spezifität aufweisen.