Quantifizierung von Proteinen mittels Protein Microarrays
Wellhausen, Robert - Freie Universität Berlin (2013)
Im Gegensatz zum Genom ist das Proteom hochvariabel. Es variiert nicht nur von Organismus zu Organismus, sondern auch zwischen verschiedenen Geweben und innerhalb eines Gewebes von Zelle zu Zelle. Grund hierfür sind unter anderem unterschiedliche Splicevarianten und posttranslationale Modifikationen (PTMs).
Diese sind zeitlich begrenzt, sehr dynamisch und abhängig vom Zellzyklus oder externen Stimuli und beeinflussen die Proteinzusammensetzung einer Zelle. Nur ein Bruchteil dieser Modifikationen spielt bei regulatorischen Prozessen eine Rolle. Eine der wichtigsten PTMs ist die Phosphorylierung von Proteinen, denn diese spielt eine entscheidende Rolle bei der Signaltransduktion und damit einhergehend, der Veränderung des Proteoms. Zum Verständnis von Signaltransduktionsevents gehört die Analyse der zeitlichen und räumlichen Dynamik von posttranslationalen Modifikationen. Deswegen ist es von besonderem Interesse diese Änderung der Verhältnisse möglichst genau zu untersuchen. Proteinbasierte Nachweismethoden, wie die Analyse mittels Reverse Phase Protein Microarrays, sind in der Lage Änderungen des Proteoms direkt nachweisen zu können.
Ziel dieser Arbeit war die relative Quantifizierung von Proteinen mittels RPMAs anhand der Stimulierung des PKA Signaltransduktionsweges. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde der gesamte Vorgang vom Herstellen der Microarrays, über den Assay auf den Slides und der Auswertung bis zur Stimulierung der Zellen optimiert. In diesem Zusammenhang wurden verschiedene Zelllinien und Stimuli getestet und die Lysebedingungen an die Anforderungen des Piezo-Spotter angepasst. Bei der Herstellung der RPMAs wurde auf eine möglichst kurze Verweildauer der Lysate und eine schnelle, automatisierte Herstellungsprozedur geachtet. Um die zeitlich unterschiedlich stimulierten Lysate miteinander vergleichen zu können wurde eine Normalisierung gegen den Gesamtproteingehalt am Ende des Assays durchgeführt. Eine Änderung der Signalintensität ist somit auf die Stimulierung und nicht auf einen unterschiedlichen Proteingehalt nach dem Spotten auf den Arrays zurückzuführen.
Die Aktivierung des PKA Signaltransduktionsweges konnte in relativen Verhältnissen dargestellt werden. Es konnte durch Stimulierung eine Aktivierung der PKA nach wenigen Minuten gemessen werden. Wie die Ergebnisse zeigen, sind Phosphorylierungen im Zelllysat nur über einen begrenzten Zeitraum stabil und die Analysedauer ab Probennahme sollte möglichst kurz gehalten werden. Dabei traten biologische Varianzen auf, welche nicht durch die Optimierung des Protokolls oder eine verbesserte Auswertung zu korrigieren waren. Faktoren wie der Grad der Konfluenz oder der Druck des Zellkulturmediums haben bereits im Vorfeld einen Einfluss auf die Signaltransduktion und konnten, auch durch ein vorangegangenes Aushungern der Zellen und eine optimierte Herstellung der RPMAs selbst, nicht minimiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die relative Quantifizierung mittels Reverse Phase Protein Microarrays möglich, jedoch von vielen Faktoren abhängig ist. Um die Vergleichbarkeit der Versuche, auch zwischen verschiedenen Laboren, zu gewährleisten ist eine strikte Einhaltung einheitlicher Protokolle von der Stimulierung der Zellen über die Prozessierung und Lagerung der Lysate unabdingbar.