Ortsaufgelöster massenspektrometrischer Nachweis und Strukturaufklärung biologischer Metaboliten in Pflanzen und Pilzen
Vergeiner, Stefan - Universität Innsbruck (2016)
Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Entwicklung und Optimierung von massenspektrometrischen Verfahren zur zweidimensionalen Darstellung von organischen Naturstoffen und der Strukturaufklärung unbekannter biologischer Kataboliten mittels Massenspektrometrie. Die Methoden wurden an zwei Systemen mit unterschiedlichen Anforderungen erprobt.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde ein neues MALDI-Matrix Beschichtungsverfahren für stark wasserhaltige Proben entwickelt. Dieses basierte auf der Anwendung einer Suspensionssprühmethode in Kombination mit einer optimierten Probenpräparation. Die dadurch erzielte Verbesserung der Matrixbedeckung führte zu einer relativen Signalverstärkung in MALDI-MSI Ionenbilder von mindestens 300 Prozent im Vergleich zu herkömmlichen Beschichtungsverfahren. Gleichzeitig konnte das Auftreten probenschädigender Prozessen ("sample flaking") deutlich minimiert werden. Das Problem der vergleichsweise hohen Nachweisgrenze sowie des geringen lateralen Auflösungsvermögens bei herkömmlichen mikrobiellen MALDI-MSI Verfahren konnte somit erfolgreich gelöst werden. Das Verfahren erlaubte die sensitive Detektion des Siderophors desferri-Triacetylfusarinin (dfTAFC) in Agarosegel-Proben aus Schimmelpilzkulturen (Aspergillus fumigatus) mit hohem lateralen Auflösungsvermögen.
Der zweite Teil dieser Arbeit befasste sich mit dem ortsaufgelösten, massenspektrometrischen Nachweis (MALDI-TOF-MSI, Abdruckverfahren) sowie der Strukturaufklärung von Chlorophyllabbaustoffen in pflanzlichen Proben am Beispiel des heimischen Adlerfarns (Pteridium aquilinum). Es ist gelungen, drei bisher unbekannte, nichtfluoreszierende Chlorophyllabbauprodukte aus dem Adlerfarn (Pteridium aquilinum) zu isolieren (Pa-NCC-1 bis Pa-NCC-3). Alle Kataboliten zeigten ein von bisher beschriebenen NCCs (z. B. Cj-NCC-1) abweichendes Verhalten in spektroskopischen sowie spektrometrischen Experimenten. Die Kombination der erhaltenen Daten ermöglichte die Erstellung vorläufiger Strukturvorschläge aus 2D-NMR, MSn, UV/Vis- und CD-Experimenten.
Die Untersuchungen ergaben, dass alle Kataboliten (mindestens) zwei bisher nicht beobachtete Struktureigenschaften besitzen:
- an Position C82 ist die in anderen NCCs beschriebene Methylester-Funktionalität durch ein Wasserstoffatom ersetzt
- (Poly-)hydroxylierungen(en) an den Kohlenstoffatomen im Ringsystem B/E und C (mono-Hydroxylierung an Position C6 im Fall von Pa-NCC-1 und Pa-NCC-3; dreifach-Hydroxylierung an undefinierten Positionen im Fall von Pa-NCC-2 (IG)
Die experimentellen Befunde (UV/Vis, CD) für die vorgeschlagenen Strukturen von Pa-NCC-1 und Pa-NCC-3 stehen im Einklang mit Resultaten aus DFT-basierten Simulationen. Darüber hinaus zeigten HPLC-ESI-MSn Experimente neuartige Fragmentierungsmuster für alle Pa-NCCs (collision induced dissociation, CID), welche vom Fragmentierungsmuster bekannter, (linearer) tetrapyrrolischer Chlorophyllkataboliten abweichen.