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Biochemische Charakterisierung und Applikation der Peroxidase MsP1

Szweda, Renata Teresa - Justus-Liebig-Universität Gießen (2016)


In den Submerskulturen des Basidiomyceten Mycetinis scorodonius wurden die Aktivitäten von Cellulasen, Xylanasen, Laccasen, diversen Peroxidasen und Esterasen über den Kulturverlauf gemessen. Kultiviert wurde auf Stroh und den Rückständen einer Biogasanlage.

Alle Enzyme zeigten ein wellenförmiges Expressionsmuster. Die Expression der Laccasen war der der β,β-Carotin abbauenden Peroxidasen nachgeschaltet. Bei den Kulturen mit den Rückständen einer Biogasanlage waren die Aktivitäten von Per- oxidasen und Laccasen bis zu 10 mal gegenüber den Kulturen auf Stroh erhöht. Für die ungewöhnliche β,β-Carotin abbauende Dyp-Typ Peroxidase MsP1 aus M. scorodonius wurde die Fähigkeit, Lignin abzubauen, mittels Messung der Partikelgrößenverteilung, Größenausschlusschromatographie, Elektronenmikroskopie und dem photometrischen Nachweis von Glucose untersucht. Für den direkten Nachweis wurde eine Suspension von organosolv Lignin eingesetzt.

Als Ergebnis dieser Untersuchung stellte sich heraus, dass MsP1 in der Lage ist, sowohl ungelöste Partikel als auch gelöste Moleküle von organosolv Lignin zu modifizieren und abzubauen. Für den indirekten Nachweis wurde MsP1 als Vorbehandlungsschritt in der Verzuckerung von Stroh mittels Cellulasen und Xylanasen eingesetzt. Damit konnte eine Steigerung in der Verzuckerungsrate von Stroh erzielt werden. Ein weiteres Einsatzgebiet für MsP1 ist die Bleichung von Milchprodukten durch den Abbau von Carotinoiden, welche nach der Färbung von Käse bis zu 20 % in der Molke verbleiben. Es wurde sowohl ein zwei- und als auch ein drei-Enzym-System zur Bleichung von Molke bzw. Milch entwickelt. Durch den Einsatz von Glucoseoxidase bzw. Glucoseoxidase und Lactase konnte das für die Bleichung mittels MsP1 benötigte H2O2 in situ generiert werden. Der zeitliche Verlauf der Bleichung wurde spektralphotometrisch nach CIELab verfolgt.

Des Weiteren wurde MsP1 biochemisch untersucht. Temperatur- und Druckoptimum von MsP1 wurden mittels dynamischer Differenzkalorimetrie, Fluoreszenz- und FT-IR-Spektroskopie sowie enzymatischen Assays mit β,β-Carotin und 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonsäure (ABTS) als Substrat untersucht. MsP1 ist thermo- und druckstabil bis zu einer Temperatur von 65 °C bzw. einem Druck von 8-10 kbar. Als Besonderheit zeigte sich eine Aktivitätserhöhung bei 500 bar, welche vermutlich auf geringe strukturelle Änderungen zurückgeht. Für einen optimalen industriellen Einsatz wurden weitere Rahmenbedingungen wie H2O2- und Lösemittel-Toleranz, pH-Optimum, sowie die kinetischen Parameter untersucht. Das pH-Optimum wurde bei pH 2,6 gefunden. MsP1 wurde schon bei geringen Konzentrationen von H2O2 gehemmt. Die inhibierende H2O2-Konzentration hängt von der Konzentration des Zweitsubstrates und des Einsatzmediums (Puffer oder Molke) ab. Die Wechselzahl (kcat) von MsP1 für die beiden Substrate β,β-Carotin und ABTS beträgt 0,38 ± (6,6 %) bzw. 176 ± (6,2 %) s-1.

Zur Steigerung der Aktivität von MsP1 gegenüber β,β-Carotin wurden Mediatoren eingesetzt. Von den vier Mediatoren Coniferylalkohol, Ferulasäureethylester, 4-Ethylphenol und p-Coumarsäure zeigte Coniferylalkohol die höchste Steigerung der Effizienz des enzymatischen Umsatzes, dies jedoch in einem die Möglichkeit des wiederholten Einsatzes von MsP1 im industriellen Gebrauch wurde MsP1 auf Kieselgel immobilisiert.


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