Entwicklung und Charakterisierung neuartiger Fluoreszenzsonden für fortgeschrittene Mikroskopiemethoden
Seefeldt, Britta - Universität Bielefeld (2011)
Die optische Mikroskopie unterliegt aufgrund der Beugung des Lichts einer Begrenzung ihres Auflösungsvermögens. In jüngster Vergangenheit wurden Methoden entwickelt, diese Begrenzung zu umgehen. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung und Bewertung von Fluoreszenzsonden für derartige Mikroskopiemethoden.
Viele Methoden der hochauflösenden Bildgebung basieren auf der Verwendung von Photoschaltern, die zwischen einem fluoreszierenden An- und einem nicht fluoreszierenden Aus-Zustand geschaltet werden können. Es gibt verschiedene Ansätze der Realisation solcher Photoschalter. In dieser Arbeit werden Photoschalter, die aus synthetischen Konjugaten aus Fluorophoren und photochromen Schalteinheiten bestehen, tiefgehend auf der Ensemble- und der Einzelmolekülebene charakterisiert und ihr Potential für die RESOLFT (Reversible Saturable Optical Fluorescent Transitions)-Mikroskopie beleuchtet. Als photochrome Einheiten wurden Spiropyrane und Diarylethene eingesetzt, die in jeweils einer ihrer Formen als eziente Energie-Transfer-Akzeptoren der Fluorophore dienen und somit deren Fluoreszenz determiniert modulieren können. Eine besondere Berücksichtigung erfährt der Aspekt der Schaltkinetiken der Konjugate zwischen dem An- und dem Aus-Zustand, da hierüber das Verhältnis der Fluorophore im An- zu denen im Aus-Zustand gesteuert werden kann. Dies ermöglicht eine Optimierung des Bildgebungsprozesses.
Besonders die Diarylethen-basierten Konjugate erwiesen sich aufgrund ihrer passenden Schaltraten und ihrer hohen Stabilität im jeweiligen Zustand als vielversprechend für einen Einsatz nach dem RESOLFT-Konzept. Ein großer Fortschritt wurde durch den Einsatz von Diarylethenen mit einem verlängerten konjugierten -System erzielt, da so ein Schalten durch UV-Licht vermieden werden konnte. Weiterhin wurde der organische Farbsto Cy5, der unter bestimmten chemischen Bedingungen ein reversibles Schalten zwischen einem An- und einem Aus-Zustand aufweist, in der dSTORM-Methode eingesetzt, um hochauflösende Fluoreszenzbilder zu realisieren. Auch hier wurde der Fokus auf die Beeinflussung der Schaltraten des Farbstoffs Cy5 zwischen dem An- und dem Aus-Zustand gesetzt.
Im zweiten Teil der Arbeit werden Einzelmoleküldaten von den fluoreszierenden Proteinen eGFP, eYFP, DsRed, mOrange und mCherry präsentiert. Die Daten der Einzelmolekül- und der Ensemblemessungen stellen mCherry durch seine hohe Photostabilität und geringen Fluktuationen der Fluoreszenz bezüglich der Intensität und der spektralen Verteilung als ideal geeigneten Fluorophor für Einzelmolekülanwendungen heraus. Durch seine spektralen Charakteristika und seine kurze Fluoreszenzlebensdauer ergänzt mCherry die Palette der fluoreszierenden Proteine und empfiehlt sich für das Tracking und die Lokalisation von Zielmolekülen mit hoher Genauigkeit. Ebenso bietet es sich für den Einsatz in Fluoreszenz Resonanten Energie Transfer (FRET)-Methoden, Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebung (FLIM) und Mehrfarbanwendungen an. Im letzten Teil der Arbeit wird die Photophysik des für die Einzelmolekülspektroskopie tauglichen fluoreszierenden Proteins eGFP durch seine chemische Umgebung beeinflusst. Ziel ist es dabei, reversible Dunkelzustände zu generieren, um das eGFP für hochauflösende Mikroskopiemethoden, die auf der Lokalisation einzelner, zeitlich separierter Fluorophore basieren, zugänglich zu machen.