Analytik und Transformation von Flavonoiden durch anaerobe und aerobe Bakterien
Schütt, Denise - Technische Universität Berlin (2014)
Seit einiger Zeit stehen die physikochemischen Eigenschaften von sekundären Pflanzenstoffen, vor allem im Hinblick auf die Gesundheit des Menschen, im Fokus vieler in vitro und in vivo Studien. Dennoch sind bis heute viele Mechanismen der Metabolisierung und Modifikation der Flavonoide und deren Abbauprodukte ungeklärt. Die vorliegende Arbeit besteht aus drei Arbeitspaketen, von denen sich ein Paket mit der Etablierung und Validierung einer reproduzierbaren Hochleistungsflüssigkeitschromatographie Methode zu Analyse der Flavonoide Cyanidin-3-O-glucosid, Cyanidin-3-O-rutinosid, Delphinidin-3-O-glucosid, Delphinidin-3-O-rutinosid und Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) sowie ihrer Abbauprodukte während der Umsetzung im in vitro Verdauungsmodell beschäftigte. Die beiden anderen Pakete betrachteten die Umsetzung der Flavonoide durch Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen in einem reproduzierbaren in vitro Verdauungsmodell und unter anaeroben Bedingungen durch das Bakterium Rhodococcus erythropolis DSM 44534.
Im in vitro Verdauungsmodel wurde die Umsetzung der Flavonoide unter enzymatischen sowie enzymatisch-mikrobiellen Bedingungen betrachtet. Dazu wurden zum einen die Anthocyane als Reinsubstanzen sowie in verschiedenen Lebensmittelmatrices eingesetzt. Bei der rein enzymatischen Umsetzung der Anthocyanaglykone wurden bereits am Ende der Duodenumpassage nur noch 0,5 % der Ausganskonzentration an Aglykonen gefunden. Bei den Glucosiden lag die Konzentration der Anthocyane während der enzymatisch-mikrobiellen Umsetzung am Ende der Metabolisierungsversuche in den verschiedenen Ansätzen zwischen 6 % und 20 % bezogen auf die Ausgangskonzentration. Für das reine Rutin konnte im Verlauf der Umsetzung eine Konzentrationsabnahme von 40 % detektiert werden. Neben dem Abbau der Flavonoide konnte auch die Bildung eines Protein-Flavonoid-Komplexes beobachtet werden, welche die Flavonoide für die Analytik maskiert und die Ergebnisse für den Konzentrationsverlauf während der Umsetzung negativ beeinflusst.
Aus diesem Grund wurde eine Resolubilisierungsmethode erfolgreich etabliert und validiert, wodurch eine korrekte Bilanzierung des Metabolismus ermöglicht wurde. Neben der starken Komplexierung der Flavonoide im Magensegment wurde vor allem ein Großteil der Anthocyane bei der Probenvorbereitung präzipitiert (63 % im Duodenum beim Gärgetränk aus Basis von Bierwürze und Johannisbeersaft). Zusätzlich konnten die Zunahme von Polymerisierungen und Copigmentierungen der Anthocyane und ihrer Abbauprodukte im Verlauf des in vitro Modells nachgewiesen werden. Überdies konnte eine Zunahme der antioxidativen Kapazität für Anthocyane und Rutin in den einzelnen Verdauungsstufen gemessen werden. Hier stieg die antioxidative Kapazität exemplarisch für den Heißwasserextrakt von 5,4 mmol/ml Troloxequivalent zu Beginn der Umsetzung auf 24,6 mmol/ml Troloxequivalent am Ende an. Die Ergebnisse zeigen, dass der Abbau der Anthocyane im in vitro Verdauungsmodell hauptsächlich auf physikochemischen Einflüssen, sowie zahlreichen Nebenreaktionen (Polymerisierung, Copigmentierung) beruht. Das Rutin hingegen wird enzymatisch-mikrobiell metabolisiert.
Im dritten Teil der Arbeit wurde durch die Zugabe von Rutin zum Kultivierungsmedium die Bildung einer Rutinase induziert, welche Rutin zu Quercetin und Rutinosid spaltet. Das Enzym wurde im Rahmen der Arbeit teilweise aufgereinigt, wobei ein isoelektrischer Punkt von 6,4 und ein Molekulargewicht von 48 kDa bis 74 kDa für die Rutinase gefunden wurden. Weiterhin wurde der Einfluss verschiedener Kohlenstoff-Quellen auf den Aufbau der Zellhülle von R. erythropolis untersucht. Die gezielte Untersuchung der Mykolsäuren mittels Elektronenspray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie zeigte, dass sich in Gegenwart von Zitronensäure im Kultivierungsmedium der Anteil an mehrfach ungesättigten Mykolsäuren (zwei-, drei- und vierfach ungesättigt) auf 35 % für die Meromykolatkette im Vergleich zu Rutin als C-Quelle mit 17 % erhöht. Im α-Alkyl-Zweig lag der Anteil bei nur 3 % für das Rutin und 23 % für die Zitronensäure. Vierfach ungesättigte Meromykolatketten konnten nur in Gegenwart von Zitronensäure als C-Quelle gefunden werden. Mit der Zunahme der ungesättigten Mykolsäuren in den Ansätzen mit Zitronensäure ging eine Veränderung der Permeabilitätsbarriere einher. Dies konnte anhand der Ergebnisse aus der Ziehl-Neelsen-Färbung belegt werden. Sowohl die Zitronensäure als auch das Rutin nahmen im Laufe der Kultivierung auf unterschiedlichen Wegen Einfluss auf die gebildeten Enzyme, das Wachstum und die Permeabilität der Rhodococcus erythropolis DSM 44534 Zelle.