EPR-Spektroskopie ermöglicht Einblicke in die Mechanismen der Hämregulation und der Reaktionskinetik

Schubert, Erik - Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn (2017)

Die für essentielle biologische Prozesse wie Atmung, Gastransport und Katalyse prosthetische Gruppe Häm findet nicht nur festgebunden an Proteine Verwendung. Es konnte in der Vergangenheit gezeigt werden, dass sie durch temporäre Bindung auch regulatorisch auf Prozesse wie Gentranskription wirken kann. Dazu bindet Häm an kurze Aminosäuresequenzen, die sogenannten HRMs. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte mittels EPR-Spektroskopie der Einfluss weiterer potentieller HRMs gezeigt werden. Untersucht wurden kurze Peptide mit potentiellen HRM auf Basis von Cystein, Histidin oder Tyrosin. Die Interaktion zwischen Hämin und Peptid waren in der Regel am stärksten für die cysteinbasierten HRMs, während sie für die histidin- und tyrosinbaiserten HRMs schwächer waren. Eine Vielzahl an Peptiden bildete sowohl fünf- wie sechsfachkoordinierte Hämin-Peptid-Komplexe. Das Verhältnis zwischen beiden Komplexgeometrien variierte abhängig vom Peptid. Die an Peptiden gewonnen Erkenntnisse wurden teilweise auf der Proteinebene weiter untersucht. Dies sollte u.a. zeigen, in wieweit die auf der Peptidebene gewonnen Erkenntnisse sich auf die Proteinebene übertragen lassen. So wurden die zwei Proteine FeoB und GlpF, die die potentiellen HRMs der stark wechselwirkenden Peptide PY5 bzw. PY4 beinhalten, exprimiert und aufgereinigt. Für das Protein FeoB konnte das potentielle HRM (PY5-Sequenz) als Hämbindemotiv nachgewiesen werden. Die Wechselwirkung mit Hämin war schwach und ortsspezifisch. Für GlpF konnte hingegen keine Bindung von Hämin festgestellt werden. Nichtsdestotrotz zeigen die Ergebnisse, dass Untersuchungen auf Peptidebene ein sinnvolles Werkzeug zur Ermittlung potentieller hämregulierter Proteine sind. In einer kurzen Peptidsequenz ist es weitaus wahrscheinlicher, dass tatsächlich das potentielle HRM für die etwaige Interaktion mit dem Hämin verantwortlich ist.

In einem zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde der dielektrische Mischresonator ER 4117 MX (Bruker), der als Konstanter-Fluss-System arbeitet, charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass mit diesem Resonator Reaktionen mit Halbwertszeiten im Bereich von Milli- bis Submillisekunden quantitativ bei Probenvolumina von 10 mL pro Zeitpunkt und Reaktand verfolgt werden können. Unter Einsatz dieses Aufbaus wurde die Kinetik des Fenton-ähnlichen Systems aus TiCl₃/ H₂O₂ und Ethanol untersucht, die Geschwindigkeitskonstanten des Initiationsschrittes, d.h. OH^•-Bildung, und des bimolekularen Zerfalls des α-Hydroxyethylradikals erfolgreich bestimmt sowie ihre gute Übereinstimmung mit früheren Berichten gezeigt. Der Effekt von Luftsauerstoffoxidation auf das α-Hydroxyethylradikal stellte sich als vernachlässigbar heraus. Des Weiteren tragen Reaktionen mit H₂O₂ und Ti^3+/4+ nur bei höheren Konzentration zum Zerfall des α-Hydroxyethylradikals bei, womit nur der bimolekulare Zerfall aus Eigenrekombination und Disproportionierung als signifikanter Zerfallsweg bleibt. Im Rahmen dieser Studie wurden durchweg vollständige EPR-Spektren verwendet, um den alleinigen Beitrag der zu untersuchenden chemischen Spezies zum beobachteten kinetischen Phänomen sicherzustellen. Diese Arbeit veranschaulicht die Stärke der EPR-Spektroskopie als direkte und empfindliche Methode in kinetischen Studien.

Nach Kalibrierung des RFQ-Aufbaus mit der Reaktion zwischen MetMb und Azid sollte diese Methode verwendet werden, um Informationen über die Kinetik der Bindung zwischen Hämin und Peptiden bzw. Proteinen zu erhalten. Allerdings zeigte sich auf der Millisekundenzeitskala kein nennenswerter Fortschritt der Häminbindung. So konnten weder der Mischresonator noch der RFQ-Aufbau für die Untersuchung der Bindungskinetik zwischen Hämin und Peptiden bzw. Proteinen eingesetzt werden. Dementsprechend wurden in anschließenden Versuchen die Hämin-Peptid/Protein-Proben von Hand gemischt und gefroren, wobei Reaktionszeitpunkte bis runter zu zehn Sekunden festgehalten werden konnten. Diese Experimente zeigten, dass sich der Bindungsprozess im Bereich von Minuten abspielte und somit nicht mit Methoden untersucht werden kann, deren Beobachtungsfenster auf Millisekunden ausgelegt ist. Für das untersuchte Peptide HB1^syn und das Protein IL-36 α ergab sich prinzipiell derselbe Ablauf des Häminbindungsvorgangs. Nach wenigen Minuten bildete sich das Maximum eines seIL-36 α chsfachkoordinierten Hämin-Komplexes aus. Dieser Komplex zerfiel dann wieder langsam mit zunehmender Zeit. Es konnte gezeigt werden, dass mit der verwendeten Technik eine Möglichkeit besteht, die Häminbindungskinetik zu untersuchen.

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