Entwicklung eines ultraschnellen elektro-optischen Scanners für STED-Nanoskopie
Schneider, Jale - Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen (2013)
Fluoreszenzmikroskopie ist eine weit verbreitete Technik in der Biologie und in anderen "Life Sciences", bei der Gewebe, Zellbestandteile oder Moleküle spezifisch gefärbt und nicht-invasiv abgebildet werden. Damit können Informationen sowohl über die Struktur, als auch über die molekularen Interaktionen innerhalb intakter biologischer Proben gewonnen werden. Seit der Erfindung der Fluoreszenzmikroskopie streben daher zahlreiche Techniken an, das Signal, die räumliche und zeitliche Auflösung der Aufnahmen zu maximieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein ultraschnelles elektro-optisches Laserscanningsystem entwickelt, das in allen drei oben genannten Punkten große Fortschritte erzielt. Das Scannersystem wurde in STED-Mikroskope integriert, die durch stimulierte Emission der Fluorophore Hochauflösung jenseits der Beugungsgrenze ermöglichen. Mit dem Scanner wurde die Pixel-Verweildauer bis auf die fundamentale Grenze der Fluoreszenzlebensdauer reduziert. Somit wurde das bislang schnellste STED-Mikroskop realisiert, das um drei bis fünf Größenordnungen höhere Bildrate im Vergleich zu konventionellen Systemen anbietet und die Beobachtung dynamischer Vorgänge mit einer Zeitauflösung von < 1 ms ermöglicht. Zudem bekam der Signalaufbau im Bild einen zeitlich stochastischen Charakter, weil jeder Pixel pro Frame maximal mit einem Puls beleuchtet wird.
Dies stellt das erste Verfahren in der Fluoreszenzmikroskopie dar, welches zeitlich stochastisch aber räumlich deterministisch ist. Der Scanner reduziert dadurch gleichzeitig das Bleichen (Verlust des Fluoreszenzsignals). Die kurze Pixel-Verweildauer minimiert die Wahrscheinlichkeit, dass Fluorophore in kurzer Folge mehrfach von einem Laserpuls getroffen werden und dadurch in Energiezustände übergehen, die zum Bleichen führen. Moleküle in solchen Zuständen können durch diese neuartige Beleuchtungsstrategie zwischen den repetitiven Scans in den Grundzustand zurückrelaxieren und so effektiv bei jedem Frame am Fluoreszenzzyklus teilnehmen. Über eine breite Auswahl an Proben und Laserkonfigurationen wird dadurch eine 1,5 bis 4,5fach höhere Photonenausbeute erreicht. Auch das Hochauflösungsvermögen des STED-Mikroskops profitiert vom schnellen Scannen. Durch die Bleichreduktion und die frei und dynamisch einstellbare Aufnahmedauer können im Vergleich zu konventionellen Aufbauten höhere Laserleistungen eingesetzt werden, die zu höheren Auflösungen führen. Sogar bei Proben mit dem sehr häufig eingesetzten und eher empfindlichen grün fluoreszierenden Protein (GFP) wurde erstmalig eine Auflösung von < 50 nm erreicht. Der ultraschnelle elektro-optische Scanner im STED-System ist somit das erste Fluoreszenzmikroskop, das im Einzelnen hohe zeitliche Auflösung bis > 1000 fps, hohe räumliche Auflösung von