Untersuchungen zum Nachweis pathogener Bakterien in Lebensmitteln mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung
Rohde, Alexander - Freie Universität Berlin (2017)
Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ist eine Nachweismethode für Mikroorganismen und stellt eine vielversprechende Alternative zum konventionellen, langsamen Kulturnachweis beziehungsweise zu anderen schnellen molekularen Detektionsmethoden ohne Möglichkeit einer Lebend/Tot-Differenzierung dar. In dieser Arbeit sollte das Potenzial von FISH für den Nachweis lebender pathogener Bakterien in Lebensmitteln evaluiert werden.
Für eine Reihe wichtiger Zoonoseerreger wie S. enterica, thermophile Campylobacter spp., pathogene Yersinien oder L. monocytogenes wurden FISH-Sonden, die auf die 16S oder 23S rRNA gerichtet sind, entworfen und getestet. Die neu entwickelten Sonden waren bereits bekannten FISH-Sonden hinsichtlich ihrer Spezifität und Sensitivität häufig deutlich überlegen. Umfangreiche thermodynamische Anpassungen und der gezielte Einsatz von Kompetitoren und Nukleotidanaloga erlaubten den spezifischen Simultannachweis vieler unterschiedlicher Erregergruppen in Gegenwart nahverwandter Bakterien. Die Kombination von FISH mit dem direct viable count (DVC-FISH) erwies sich als zuverlässige Methode zur Lebend/Tot-Unterscheidung. Mit Hilfe eines FISH-Tests auf mRNA-Ebene, der durch den Einsatz eines Sondengemisches auch Zielsequenzen mit geringer Abundanz erfassen kann, konnte zusätzlich die Transkription von Antibiotikaresistenzgenen auf Einzelzellebene detektiert werden. Die Kugelmühle FastPrep-24 und mit Einschränkungen der Stomacher erwiesen sich als geeignete Homogenisierungssysteme zur Probenvorbereitung, um lebende Bakterien aus einer festen Lebensmittelmatrix herauszulösen. Nach einer ein- bis zweitägigen kulturellen Voranreicherung erreichten die entwickelten FISH-Tests eine vergleichbare Sensitivität wie die deutlich zeitaufwändigeren Goldstandardmethoden. Eine kulturunabhängige Anreicherung gelang durch mehrstufige Vorfiltrationen und nichtfluoreszierende Membranfilter. Die Zugabe eines Markerbakteriums ermöglichte gleichzeitig die Quantifizierung der Bakterienlast.
FISH repräsentiert eine Brückentechnologie, die die Geschwindigkeit anderer Schnellnachweise mit der Eigenschaft der kulturellen Methoden zur Unterscheidung von lebenden und toten Bakterien verbindet. Um FISH als eine anerkannte Technik in der Lebensmittelmikrobiologie zu etablieren, müssen jedoch die Automatisierung und Standardisierung dieser Nachweismethode weiter vorangetrieben werden.