Molekulare Charakterisierung neuartiger Biokatalysatoren aus Basidiomyceten
Riemer, Stephanie Johanna Luise - Justus-Liebig-Universität Gießen (2010)
Basidiomyceten als die am höchsten entwickelten Pilze stellen aufgrund ihrer komplexen Ausstattung an intra- und extrazellulären Enzymen wertvolle Werkzeuge für die Lebensmittelbiotechnologie dar. Da das stark viskositätserhöhende beta-1,3-1,6-D-Glucan Cinerean die Herstellung von Säften und Weinen erschwert, wurden 29 Basidiomyceten in einem Screeningverfahren mit Cinerean als Induktor auf beta-Glucanaseaktivität untersucht. 19 von ihnen zeigten potentielle beta-Glucanaseaktivität, die mit Hilfe des für Endoaktivität spezifischen Substrats Laminarin azur (beta-1,3-1,6-D-Glucan kovalent verknüpft mit Remazol Brillantblau R) näher charakterisiert wurde.
Kulturüberstände von Phanerochaete chrysosporium zeigten die höchste Endoaktivität gegenüber Laminarin azur. Bei einem pH-Optimum von 5,0 wurde ein Temperatur-Optimum von 63 °C bis 68 °C ermittelt. Im Kulturüberstand wurden nach isoelektrischer Fokussierung 2 Enzyme nachgewiesen, die Aktivität gegenüber Laminarin zeigten. Die jeweiligen isoelektrischen Punkte betrugen 6,7 und 5,5. Die Analyse der Laminarinabbauprodukte mittels Größenausschlusschromatographie, gekoppelt mit einem Verdampfungslichtstreudetektor (SEC-ELSD), wies auf eine Endoaktivität hin. Mit Hilfe der Gelfiltrationschromatographie wurde eine Endo-beta-Glucanase mit einem Molekulargewicht von 39 kDa (GFC) bzw. 42 kDa (denaturierende SDS-PAGE) bis zur elektrophoretischen Homogenität gereinigt und nach tryptischem Verdau mittels ESI-MS/MS de novo ansequenziert. Die erhaltenen Peptidsequenzen zeigten hohe Homologien zu einer Endo-1,3(4)-beta-Glucanase aus Phanerochaete chrysosporium.
Basierend auf den ermittelten Peptidsequenzen wurde die für die Endo-beta-Glucanase kodierende cDNA mit 948 bp kloniert. Nach Anpassung der Nukleotidsequenz an die Codon Usage von E. coli wurde die Endo-beta-Glucanase heterolog exprimiert und mittels Western Blot nachgewiesen.
Aus dem Basidiomyceten Pleurotus sapidus wurde die kodierende cDNA einer Oxygenase, die (+)-Valencen zu (+)-Nootkaton zu transformieren vermag, mit 1.191 bp kloniert. Die cDNA-Sequenz zeigte eine hohe Homologie zu einer mutmaßlichen Lipoxygenase aus dem nah verwandten Pilz Pleurotus ostreatus. Für die heterologe Expression der Oxygenase wurde die Nukleotidsequenz an die Codon Usage von Hansenula polymorpha angepasst. Die Expression wurde mittels Western Blot und oxygenasespezifischen Antikörpern nachgewiesen. Sowohl gegenüber (+)-Valencen als auch gegenüber dem für Lipoxygenasen typischen Substrat Linolsäure zeigte das rekombinante Enzym keine Aktivität.