Spektroskopische Untersuchungen zur Singulett-Sauerstoff-Lumineszenz in Biomolekülen, Bakterien und Zellen
Regensburger, Johannes - Universität Regensburg (2010)
Die photodynamische Therapie (PDT), wie sie seit über 100 Jahren angewandt wird, basiert auf der Wechselwirkung von Licht, Farbstoff und Sauerstoff. Die Wirkung der PDT beruht auf der Zerstörung von Zellen durch Oxidation, hauptsächlich durch Singulett-Sauerstoff. Die PDT wird zur Behandlung maligner und prämaligner Gewebeveränderungen eingesetzt. Ein neuer Bereich für die Anwendung ist die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT), bei der Mikroorganismen, wie Bakterien oder Pilze, auf die gleiche Weise wie bei der PDT, abgetötet werden sollen. Dafür ist allerdings zuerst ein besseres Verständnis der Interaktionen von Singulett-Sauerstoff, den verwendeten Farbstoffen und den Mikroorganismen notwendig. Des weiteren ist für die Anwendung von Photosensibilisatoren in der aPDT eine wichtige Voraussetzung, dass die Inkubationszeit der Farbstoffe kürzer ist, als die Zeit, die die Zellen und Bakterien benötigen, um sich zu teilen. Außerdem muss ein therapeutisches Fenster gefunden werden, also Bedingungen, bei denen die Bakterien bereits sterben, die Körperzellen jedoch noch überleben.
Aus all diesen Gründen müssen die Bedingungen am Ort der Wechselwirkung zwischen Singulett-Sauerstoff und den Mikroorganismen näher betrachtet werden. Dazu wurden die bereits bekannten theoretischen Modelle für die Generierung und Relaxation von Singulett-Sauerstoff verwendet, wobei die Sauerstoffabhängigkeit der verschiedenen Prozesse besonders betrachtet wurde. Zusätzlich wurde auf oxidative Prozesse an zelleigenen Materialien und die Diffusion von Sauerstoff eingegangen.
Zentrale Aufgabe im Rahmen der vorliegenden Arbeit war der direkte Nachweis von Singulett-Sauerstoff mittels zeitlich und spektral aufgelöster Detektion seiner Lumineszenz im Infrarot-Bereich. Auf Grund der extrem schwachen Lumineszenz von Singulett-Sauerstoff kam ein hochempfindlicher Infrarot-Photomultiplier zum Einsatz, der in Kombination mit einer schnellen Zähleinrichtung eine Zeitauflösung von etwa 100 ns ermöglichte. Durch weitere Verbesserungen im Bereich der verwendeten Interferenzfilter und der Sauerstoff-Detektion durch einen externen Sensor, konnte das Verhalten von Singulett-Sauerstoff in komplexer werdenden Umgebungen betrachtet werden.
In einfachen Farbstoff-Lösungsmittel-Gemischen wurden die Farbstoffe XF73 in Wasser und Perinaphthenon in Ethanol, als mögliche Photosensibilisatoren für die aPDT, untersucht. Dabei diente TMPyP sowohl in Wasser, als auch in Ethanol als Referenzfarbstoff. Durch die Variation der Sauerstoff-, Farbstoff- und Quencher-Konzentration konnten die relevanten Raten und Ratenkonstanten für die Generierung und Relaxation von Singulett-Sauerstoff in einfachen Lösungen bestimmt werden. Es zeigt sich, dass die Singulett-Sauerstoff-Abklingdauer im wesentlichen vom Lösungsmittel und der Quencher-Konzentration abhängt. Wohingegen sich die Farbstoff-Triplett-Abklingdauer hauptsächlich nach der Sauerstoff-Konzentration am Ort des angeregten Farbstoffs richtet.
Um sich den Verhältnissen in Zellen anzunähern, wurden zunächst die Erzeugung und Deaktivierung von Singulett-Sauerstoff in Lösungen untersucht, die Fettsäuren oder Proteine enthielten. Dabei zeigte sich, dass durch die Oxidation der Biomoleküle die Lumineszenzsignale sich bereits innerhalb der Detektionsintervalle ändern können, so dass eine Anpassung der Parameter (kürzere Messdauern, Einsatz eines Magnetrührers) notwendig wurde, um die Raten und Ratenkonstanten von Singulett-Sauerstoff unter definierten Bedingungen zu bestimmen. Die Proteine und die ungesättigten Fettsäuren waren in der Lage Singulett-Sauerstoff physikalisch und chemisch zu quenchen, wobei der Sauerstoffverbrauch durch das chemische Quenchen beobachtet werden konnte. Dieser wurde in Abhängigkeit von der Molekülgröße bei Proteinen, bzw. der Anzahl der Doppelbindungen bei Fettsäuren bestimmt. Dabei zeigte sich, dass je kleiner die Proteine, bei gleichbleibender Gesamtmasse, oder je ungesättigter die Fettsäuren waren, desto mehr Sauerstoff verbraucht wurde. Der Einfluß des Sauerstoffverbrauchs zeigte sich am deutlichsten bei der Bestimmung der Farbstoff-Triplett-Abklingdauer, die sehr empfindlich auf die Abnahme der Sauerstoff-Konzentration reagierte und eine Abschätzung der Sauerstoff-Konzentration am Ort der Laseranregung zu ließ, da diese nicht durch den Sauerstoffsensor bestimmbar war. Auch konnte der quenchende Einfluß der Proteine und der ungesättigten Fettsäuren auf die Singulett-Sauerstoff-Abklingdauer abgeschätzt werden.
Im Rahmen der Untersuchungen zu Fettsäuren hat sich ergeben, dass Singulett-Sauerstoff durch Anregung mit UVA-Strahlung auch ohne einem Photosensibilisator erzeugt werden kann. Dabei wurde festgestellt, dass nur die mehrfach ungesättigten In der Lage waren über einen längeren Zeitraum Singulett-Sauerstoff in messbaren Mengen zu generieren. Entscheidend dabei war die Menge der oxidierten Fettsäuren, die, wie am Beispiel der Arachidonsäure durch HPLC-Analysen gezeigt, mit der Menge an erzeugtem Singulett-Sauerstoff korreliert. Durch den Russel-Mechanismus wurde auch noch eine möglicher Weg zur Erzeugung von Singulett-Sauerstoff aus den nachgewiesenen Lipidhydroperoxiden vorgestellt.
Erstmals war es möglich die Lumineszenzsignale von Photosensibilisatoren aus Zellen und Bakterien unter verschiedenen Bedingungen (O2-Konzentration, Zelltyp) zu detektieren und auszuwerten. Dabei zeigte sich, dass der Sauerstoffverbrauch bei den Gram-positiven S. aureus-Bakterien unabhängig vom verwendeten Farbstoff ist, bei den Gram-negativen E. coli jedoch im Vergleich zu TMPyP ein stärkerer Verbrauch bei XF73 festgestellt werden konnte. Aus den Lumineszenzsignalen konnten die Anstiegs- und Abklingzeiten eindeutig der Farbstoff-T1-Abklingdauer und der Singulett-Sauerstoff-Abklingdauer zugeordnet werden.
Durch die ermittelten Farbstoff-T1-Abklingzeiten bei Zellen und Bakterien konnten die Sauerstoff-Konzentrationen in der Umgebung der verwendeten Farbstoffe abgeschätzt werden und somit, ebenso wie aus den Singulett-Sauerstoff-Abklingzeiten, die Veränderungen in der Lokalisation der Farbstoffe, wie sie in den Fluoreszenzbildern beobachtet wurden, zumindest bei den Zellen bestätigt werden. Bei den XF73-inkubierten Bakterien lag die Sauerstoff-Konzentration und die Singulett-Sauerstoff-Abklingdauer bei niedrigeren Werten als bei TMPyP-inkubierten. Diese Beobachtungen lassen sich mit einer besseren Aufnahme des neuen Farbstoffs XF73 gegenüber dem Referenzfarbstoffs TMPyP erklären. Auch konnte bei den Gram-positiven S. aureus-Bakterien ein höherer Sauerstoffverbrauch als bei E. coli-Bakterien beobachtet werden, so dass von einer besseren Wirksamkeit der Farbstoffe bei Gram-positiven als bei Gram-negativen Bakterien ausgegangen werden kann.
Durch die somit erhaltenen Ergebnisse wurden aber auch neue Fragen aufgeworfen. So muss für weiterführende Messungen die Lokalisation der Farbstoffe in Bakterien durch chemische Analysen bestimmt werden, ebenso wie die Abhängigkeit der Lumineszenz und der Zelltoxizität von der Menge des aufgenommenen Farbstoffs. Dazu kann gegebenenfalls auch die Entwicklung neuer Farbstoffe notwendig sein, die besser von Zellen oder Bakterien aufgenommen werden.
In dieser Arbeit konnte erstmals die Generierung von Singulett-Sauerstoff durch Fettsäuren ohne Sensibilisator unter UVA-Bestrahlung festgestellt werden, jedoch sind noch weitere Experimente mit effektiven Quenchern notwendig, um den Mechanismus der Singulett-Sauerstoff-Generierung vollständig zu klären. Für weitere Untersuchungen von endogenen Photosensibilisatoren, wie Fettsäuren oder Proteinen, bieten sich Untersuchungen im nahen UVB-Bereich an, da dort die Moleküle höhere Absorptionswirkungsquerschnitte besitzen, wodurch wegen der verstärkten Absorption bessere Signale erzeugt werden können. Auch können somit weitere körpereigene Moleküle, wie Urocaninsäure oder L-alpha-Phosphatidylcholin, auf Singulett-Sauerstoff-Generierung getestet werden.