HCV-Diagnostik mittels genotypspezifischer Antikörper
Püttmann, Maria Christiane - Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen (2010)
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die HCV-Hüllproteine E2 der Genotypen 1b, 2 und 3 genutzt, um eine Ak-basierte HCV-Diagnostik zu ermöglichen.
Die Sequenz des Genotyps 1b wurde aus einem Patienten isoliert und konnte direkt zur Expression verwendet werden. Für die Genotypen 2 und 3 wurden Konsensussequenzen aus allen in der Los Alamos-Datenbank verfügbaren Sequenzen abgeleitet. Diese Sequenzen wurden synthetisch hergestellt und anschließend in E. coli und verschiedenen Säugetierzellen zur Expression der Proteine verwendet. Zur Verbesserung der Expression wurde die Transmembranregion am C-Terminus der Proteine deletiert, sodass hier mit um etwa 80 AS verkürzten Proteinen gearbeitet wurde. Durch die Verkürzung deutlich über die Transmembranregion hinaus konnte die Proteinausbeute vervierfacht werden. Nach Testen verschiedener Expressionssysteme zeigte sich, dass die verschiedenen E2-Proteine am besten durch pET26b+ (Novagen) in E. coli produziert wurden und die Reinigung unter denaturierenden Bedingungen zu 95% sauberem Protein führt. Im Gegensatz zu der erfolgreichen Expression in E. coli konnten verschiedene Säugetierzellen zwar transfiziert werden, doch rekombinantes Protein konnte weder durch Reinigung und Westernblot, noch durch Bindung an CD81-positive Zellen in der Durchflusszytometrie nachgewiesen werden.
Neben den synthetischen Konsensussequenzen für die Genotypen 2 und 3 wurden auch genotypspezifische Peptide abgeleitet. Diese Peptide sind in einem Bereich lokalisiert, der nur einem geringen Mutationsdruck unterliegt und zwischen den Genotypen mindestens 85% Homologie aufweist. Zur Gewinnung von mAk gegen das HCV-Protein wurden Immunisierungen mit verschiedenen Proteinen durchgeführt. Dazu wurden Mäuse mit zwei E2(1b)-Fragmenten , dem Volllängenprotein E2(1b) und einer Kombination der einzelnen Peptide immunisiert. Auf diesem Weg wurden 13 verschiedene Ak gewonnen, welche nicht nur E2(1b), sondern auch die anderen Genotypen binden. Durch Verwendung verschiedener Proteinbereiche erkennen die Ak der einzelnen Fusionen verschiedene Epitope im Volllängenprotein und können auch in einem Sandwich-ELISA eingesetzt werden. Durch die Immunisierung mit den Peptiden wurden Ak generiert, die in der Lage sind, zwischen den einzelnen Genotypen zu unterscheiden.
Durch Kombination der einzelnen Ak in einem ELISA ist durch Vergleich der Signalstärke eine Bestimmung des Genotyps der vorliegenden Probe möglich. Zur Verbesserung der Affinität der Ak und zur Verstärkung der Bindung an die verschiedene Genotypen wurden mit Hilfe eines neuen Primersatzes durch eine zweistufige Klonierungsstrategie scFv kloniert und exprimiert. Nachdem die Bindung der scFv gezeigt werden konnte, wurde eine in-vitro-Evolution durch zufällige PCR mit Hilfe des Basenanalogons hmdCTP durchgeführt. Durch Einsatz dieses Nukleotids wurden gezielt Punktmutationen eingefügt, die auch auf AS-Ebene zu Mutationen führen. Nach der Mutation wurde mit Hilfe der "Phage Display"-Technologie nach positiven Bindern gesucht, doch unabhängig von Phagenwirt und verschiedenen "Panning"- und Kultivierungsparametern konnten nur Artefakte nachgewiesen werden. Eine Verbesserung der ursprünglichen scFv konnte nicht erzielt werden. Auch wenn der Ak-basierte Nachweis verschiedener HCV-Genotypen bisher noch nicht möglich ist, können die einzelnen Peptide zur Diagnose einer Infektion eingesetzt werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Seren von Patienten mit einer Genotyp 1-Infektion untersucht, und es konnte gezeigt werden, dass humane Ak an die Peptide binden. Erwartungsgemäß wurde die höchste Aktivität auf dem Genotyp 1-Peptid erreicht, da die getesteten Proben HCV Genotyp 1 enthielten. Eine Erweiterung der Studie um weitere Seren und andere Genotypen ist nötig, um diese Daten zu validieren. Zum jetzigen Zeitpunkt erscheint eine genotypspezifische Diagnose durch die Peptide möglich.