Untersuchung der Oberfläche von Kohlenstoffallotropen durch innovative Oligonukleotid-basierte Sonden und deren Eigenschaften als Träger von Oligonukleotiden in die Zelle
Pieper, Hanna - Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (2015)
Im Rahmen dieser Arbeit konnten fluorogene Oligonukleotidsonden entwickelt werden, welche in der Lage sind, bereits geringe Mengen an Endoperoxiden auf der Oberfläche von Graphenoxid (GO) erstmalig zu detektieren und zu quantifizieren. Weiterhin wurden Verfahren entwickelt, mit welchen Endoperoxide und andere hochreaktive funktionelle Gruppen (C-zentrierte Radikale, Mn2+ Ionen) von der Oberfläche von GO entfernt werden können. Dies wurde dafür genutzt, Ausmaß und Ursache der Toxizität von GO in humanen Gebärmutterhalskrebszellen näher zu untersuchen. Hierbei konnten Endoperoxide auf GO als Ursache der Erhöhung des oxidativen Stresses der Zelle und der damit verbundenen steigenden Toxizität identifiziert werden. Der Einfluss anderer reaktiver Spezies (C-zentrierte Radikale, Mn2+ Ionen) sowie einer unterschiedlichen Zellgängigkeit der GOs konnten unterdessen als Ursachen ausgeschlossen werden. Zusammen mit den in dieser Arbeit entwickelten Methoden der Entfernung dieser reaktiven Gruppen von der Oberfläche sind dies wertvolle Erkenntnisse für die Entwicklung von biokompatiblen und nicht-toxischen GO-Proben für biomedizinische Anwendungen.
Weiterhin wurde im Rahmen dieser Arbeit eine optimierte Methode der Transfektion mit Kohlenstoffallotropen entwickelt. Ihre Effizienz zum Einführen von Oligonukleotidkonjugate in die Zelle wurde mithilfe verschiedener Modell-Systeme zur Detektion von Nukleinsäuren in lebenden Zellen untersucht. Von den untersuchten Kohlenstoffallotropen zeigten, oxidierte und mit Base behandelte einzelwandige Kohlenstoffnanoröhrchen (SWNTs) die besten Transportereigenschaften Es wurde ein neues System zur Nukleinsäurendetektion mittels der Fluoreszenz eines Reporterstranges unter Ausnutzung der fluoreszenzlöschenden Wirkung der Kohlenstoffallotrope entwickelt. Die entsprechenden Konjugate konnten mithilfe der Kohlenstoffallotrope in die Zelle eingeschleust und hier zur erfolgreichen Detektion der beiden untersuchten zellulären Oligonukleotide (β-Actin-mRNA und 28S-rRNA) verwendet werden. Mit der entwickelten Transfektionsmethode konnte weiterhin eine photokontrollierte Templat-gesteuerten Reaktion zur Detektion von β-Actin-mRNA in lebenden Zellen erfolgreich eingesetzt werden. Die Ergebnisse konnten durch die Verwendung eines kommerziellen Transfektionsreagenz bestätigt werden. Es konnte weiterhin eine deutliche Reduktion des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses der Detektionsreaktion in vitro erreicht werden.