Biochemische Untersuchungen zur Funktion, Struktur und Phosphorylierung des Stressproteins CDeT11-24 aus der trockentoleranten Pflanze Craterostigma plantagineum
Petersen, Jan - Ruhr-Universität Bochum (2014)
Die trockentolerante Wiederauferstehungspflanze Craterostigma plantagineum, die Dürreperioden durch Ausbildung eines Ruhestadiums überleben kann, ist schon seit vielen Jahren ein wichtiges Modellsystem zur Erforschung der molekularen Mechanismen der Austrocknungstoleranz. Von der Pflanze werden im Verlauf der Austrocknung verschiedene Schutzmaßnahmen eingeleitet, zu denen unter anderem die Akkumulation des Proteins CDeT11-24 zählt, dessen Expression durch Austrocknung und ABA bisher gut untersucht wurde. Des Weiteren konnte für das CDeT11-24 Protein nachgewiesen werden, dass es erst in einer späten Phase der Austrocknung, anscheinend ABA-unabhängig phosphoryliert wird. Die eigentliche Funktion des Proteins und seiner Phosphorylierung in Bezug auf die Austrocknungstoleranz waren bisher unbekannt. Aus diesem Grund wurden in der vorliegenden Arbeit die Funktion, Struktur und Phosphorylierung des CDeT11-24 Proteins eingehender untersucht.
Mit Hilfe von Liposomen-Assays und Protein-Lipid-Overlay-Assays gelang es, eine Bindung von rekombinantem CDeT11-24 Protein an Phosphatidsäure nachzuweisen. Um den Einfluss des N terminalen Lysin-reichen Sequenzelements zu untersuchen, wurde das Deletionskonstrukt ΔK-CDeT11-24 hergestellt. Diese Deletion führte zu einer starken Reduktion der Protein-Lipid-Interaktion, wodurch eine Beteiligung des Lysin-reichen Sequenzelements an der Phosphatidsäure-Bindung bewiesen werden konnte. Trotzdem ergaben sich Hinweise darauf, dass auch eine weitere Bindungsdomäne bestehen muss.
Ein weiterer Ansatz zur Erforschung der Funktion des CDeT11-24 Proteins lag in der Durchführung von Enzym-Austrocknungs-Assays. Diese belegen, dass das CDeT11-24 Protein Citratsynthase und Lactatdehydrogenase vor einem durch Austrocknung bedingten Aktivitätsverlust schützten kann. Aus diesem Grund wird eine proteinstabilisierende Funktion des CDeT11-24 Proteins postuliert. Für das Deletionskonstrukt ΔK-CDeT11-24 hingegen, konnte nur eine schwache Schutzfunktion ermittelt werden, womit eine zweite bedeutende Funktion für das Lysin-reiche Sequenzelement des CDeT11 24 Proteins ermittelt werden konnte.
In Bezug auf die Struktur des CDeT11-24 Proteins wurde durch CD-Spektroskopie gezeigt, dass das CDeT11-24 Protein in Lösung größtenteils in Random-Coil-Konformation vorliegt und daher ein intrinsisch-ungeordnetes Protein ist. Eine Strukturänderung durch die Phosphorylierung des CDeT11-24 Proteins konnte hingegen nicht belegt werden. Auch das ΔK CDeT11-24 Protein zeigte keine veränderte Struktur im Vergleich zum Gesamtkonstrukt des Proteins. Dies lässt vermuten, dass die für das Lysin-reiche Sequenzelement durch in silico Analysen vorhergesagte amphipathische Helix sich möglicherweise erst durch eine Bindung an Phosphatidsäure ausbildet. Es konnte für das CDeT11-24 Protein jedoch eine "disorder to order"-Transition von Random-Coil- zu α-Helix-Konformation durch Trifluorethanol, SDS und Austrocknung bewiesen werden. Hierdurch ergeben sich Hinweise darauf, dass das CDeT11-24 Protein eine dynamische Konformation besitzt und möglicherweise erst durch Austrocknung oder Bindung an Interaktionspartner seine funktionelle Konformation annimmt.
Ein weiterer Teil der vorliegenden Arbeit bestand in der Isolierung und Identifizierung von CDeT11 24 Kinasen. Mit Hilfe von chromatographischen Reinigungsverfahren wurde dabei Gesamtprotein aus getrockneten C. plantagineum Pflanzen aufgetrennt und durch In-Gel bzw. in vitro Kinase Assays auf Kinaseaktivität getestet. Durch diese biochemische Reinigungsstrategie gelang es, zwei Kinasen so weit aufzugreinigen, dass es möglich war, sie massenspektrometrisch zu identifizieren. Diese Kinasen (CK2α und VIK) werden beide in der Literatur mit osmotischen Stress in Verbindung gebracht und sind daher vielversprechende Kandidaten für die Phosphorylierung des CDeT11-24 Proteins während der Austrocknung von C. plantagineum. Um eine biologische Relevanz unter physiologischen Bedingungen bestätigen zu können sind allerdings noch Untersuchungen der Phosphorylierungsspezifität nötig.