Etablierung und Evaluierung serologischer Teste zur Detektion hochpathogener Arboviren
Litzba, Nadine - Freie Universität Berlin (2011)
Für viele tropische Infektionserreger herrscht ein Mangel an guten, kommerziell hergestellten, serologischen Testen. Meist beruht die serologische Diagnostik für arbovirale Erreger auf in-house Testen und ist nur in wenigen Laboren verfügbar. Eine schnelle Diagnostik ist jedoch unerlässlich, um z.B. eine eingeschleppte, tropische Krankheit erkennen und im Notfall die nötigen Gegenmaßnahmen treffen zu können.
Um einer größeren Zahl von Laboratorien qualitätsgesicherte, serologische Nachweissysteme zur Verfügung zu stellen, wurden im Rahmen der Promotionsarbeit umfangreiche Testevaluierungen für die fünf folgenden, mit Virus-Vollantigen hergestellten Immunfluoreszenzteste (IIFTs) durchgeführt und die Ergebnisse ausgewertet: anti-Chikungunya-Virus (CHIKV), anti-Japanisches Encephalitis-Virus (JEV), anti-Dengue-Virus (DENV), anti-Sandfliegen-Fieber-Viren (SFV) und anti-Rifttalfieber-Virus (RVFV) IIFT. Zudem wurden zwei rekombinante Testsysteme, für das Krim-Kongo Hämorrhagisches Fieber-Virus (CCHFV) und das DENV entwickelt und beide Teste ebenfalls in einer Studie mit charakterisierten Serumpanels evaluiert.
Der anti-CHIKV IIFT wurde im Vergleich zu zwei in-house Testen evaluiert. Er zeigte für IgM eine Sensitivität von 96,9 %, sowie eine Spezifität von 98,3 %. Für den IgG-IIFT wurde eine Sensitivität von 95,4 % und eine Spezifität von 100 % berechnet.
Die Evaluierung des anti-JEV IIFTs wurde im Vergleich zu zwei kommerziellen ELISAs und einem Plaque-Reduktions-Neutralisationstest (PRNT) durchgeführt. Der IgM-IIFT zeigte im Vergleich zum Panbio IgM-ELISA eine Sensitivität von 86 % und eine Spezifität von 95 %. Im Vergleich zum InBios IgM-ELISA wurde für den IgM-IIFT eine Sensitivität von 83,9 % und eine Spezifität von 100 % ermittelt. Der IgG-IIFTs zeigte im Vergleich zum PRNT eine Sensitivität von 93,8 % und eine Spezifität von 100 %.
Der anti-DENV IIFT wurde hinsichtlich der Fähigkeit untersucht, den per PCR bestimmten Serotyp der Infektion serologisch zu identifizieren. Mittels des IgM-IIFTs, konnten 52 % der IgM-reaktiven Seren mit dem anti-DENV IIFT richtig serotypisiert werden. Bei weiteren 48 % der Seren zeigten mehrere Serotypen eine gleich starke Fluoreszenz. Bei 92 % dieser Seren war jedoch der per PCR bestimmte, unter den am stärksten reaktiven Serotypen.
Der anti-SFV-IIFT wurde mit zwei kommerziell erhältlichen Testen, einem anti-Toscana-Virus (TOSV) ELISA und einem anti-TOSV Blot, verglichen. Die stärkste Reaktivität im ELISA und Blot konnte in den 25 Seren gefunden werden, die im IIFT sowohl mit dem SFV Naples- als auch mit dem TOSV-Substrat reagiert hatten. Während im ELISA 28 % der Seren als positiv detektiert wurden, waren 98 % der Seren im Blot positiv. In den 46 Seren, die im IIFT ausschließlich mit dem TOSV-Substrat reagiert hatten, wurden mit dem ELISA 10,9 % als grenzwertig und mit dem Blot 30 % als positiv identifiziert. Der IIFT zeigte insgesamt eine höhere Sensitivität als der Blot, und eine viel höhere Sensitivität als der ELISA.
Der anti-RVFV IIFT wurde im Vergleich zu einem in-house ELISA evaluiert. Die Spezifität des IgM-IIFTs lag bei 99,4 %, die Sensitivität konnte aufgrund der zu geringen Probenanzahl nicht ermittelt werden. Der IgG-IIFT zeigte eine Sensitivität von 93,3 % und eine Spezifität von 99,5 %.
Es wurde ein rekombinanter anti-CCHFV IIFT entwickelt. Dafür wurde zunächst die Transfektion und Expression des Nukleoproteins und der Glykoproteine in HEK 293RKI-Zellen optimiert. Der anti-CCHFV IIFT wurde im Anschluss mit vier verschiedenen Serumpanels, die in verschiedenen in-house ELISAs als anti-CCHFV-positiv vorcharakterisiert worden waren, und einem Panel von Blutspenderseren analysiert. Die Ergebnisse dieser Serumpanels, v.a. für den IgM-IIFT, unterschieden sich stark. Die Sensitivitäten für den IgM-IIFT lagen bei 54,3 %, 44,4 %, 93,3 %, sowie 92,9 % und die Spezifität bei 97,8 %. Für den IgG-IIFT lagen die Sensitivitäten bei 83,3 %, 100 %, 100 % und 69,2 % und die Spezifität bei 100 %.
Für den rekombinanten anti-DENV Test wurden die vier NS1-Proteine ebenfalls jeweils in HEK 293RKI-Zellen exprimiert. Eine korrekte Serotypisierung war mit dem IgG-IIFT im Panel 1 bei 54,5 % der IgG-reaktiven Seren und im Panel 2, das hauptsächlich aus Seren nach Sekundärinfektion bestand, bei 28,6 % der IgG-reaktiven Seren möglich. Werden im Panel 1 nur die Seren mit den reaktiven DENV-Serotypen 1, 2 und 4 betrachtet, so konnten 75 % im IgG-IIFT richtig serotypisiert werden.
Insgesamt zeigten die verschiedenen IIFTs im Vergleich zu den verwendeten in-house bzw. kommerziellen Testen, vergleichbare Ergebnisse und können in den Laboratorien als evaluierte Alternativen zur Diagnose von tropischen, arboviralen Erkrankungen eingesetzt werden. Der IIFT stellt eine schnelle und effiziente Testplattform dar, mit der man vor allem Einzelseren, für die eine Untersuchung im ELISA zu aufwendig ist, analysieren kann.
Die Entwicklung rekombinanter IIFTs bietet zudem eine interessante Möglichkeit serologische Teste für Erreger der biologischen Sicherheitsstufe 4 (BSL-4) ohne größere Hindernisse herzustellen, und so auch für höher pathogene Erreger kommerzielle, serologische Diagnostika vielen Laboren zugänglich zu machen. Weiterhin lassen sich durch die Auswahl wenig kreuzreaktiver Proteine bzw. spezifischer Proteinbereiche in rekombinanten Testsystemen störende Kreuzreaktivitäten reduzieren. Insgesamt stellen rekombinant hergestellte Virusantigen-Substrate eine vielversprechende Alternative für die Herstellung von IIFT-BIOCHIPs dar.