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Molekulare Charakterisierung lignocellulolytischer Enzyme aus dem Sekretom von Pleurotus sapidus

Lauber, Christiane - Justus-Liebig-Universität Gießen (2015)


Der Weißfäulepilz Pleurotus sapidus (PSA) sekretiert zahlreiche Enzyme, darunter ligninolytische Redoxenzyme und Hydrolasen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die codierenden DNA-Sequenzen einer Arylalkoholoxidase (AAO), einer Peroxidase vom DyP-Typ (DyP) und einer GDS(L)-Lipase aus dem Sekretom von PSA mit Hilfe von cDNA-Bibliotheken kloniert und sequenziert.

Die Arylalkoholoxidase wurde heterolog in E. coli exprimiert. Da das Enzym hauptsächlich in inclusion bodies abgelagert wurde, wurden mehrere Strategien angewandt, um aktives Enzym direkt in löslicher Form oder durch Rückfaltung aus den inclusion bodies zu gewinnen. Die Fusion mit dem löslichkeitsfördernden Maltose-Bindeprotein führte bei der Expression zu geringen Mengen löslichem, aber dennoch inaktivem Protein. Durch die Koexpression der Arylalkoholoxidase mit Chaperonen bei niedrigen Temperaturen wurden geringe Mengen des Proteins funktionell produziert. Mit den untersuchten Expressionssystemen wurden keine ausreichenden Mengen lösliche, aktive AAO gewonnen. Daher wurde das Enzym schließlich aus inclusion bodies durch Denaturierung gewonnen und mittels Affinitätschromatographie gereinigt. Das solubilisierte Enzym wurde in vitro durch blitzartige Verdünnung (flash dilution) in Rückfaltungspuffer renaturiert. Dabei wurden Aktivitätsausbeuten von ~190 U L-1 erzielt. Die rückgefaltete, gereinigte AAO (AAO*) wurde biochemisch charakterisiert sowie pH- und Temperatur-Optima bestimmt. Daneben wurden die kinetischen Parameter (Km und kcat) sowie die katalytische Effizienz (kcat/Km) für verschiedene Substrate (Benzyl-, p-Anis-, Veratryl- und Zimtalkohol) bestimmt.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig eine DyP-Typ Peroxidase aus einer Pleurotus-Art heterolog expimiert. Die rekombinante Produktion erfolgte durch die Firma AB Enzymes in Trichoderma reesei. Für die Reinigung der DyP aus dem Kulturüberstand wurde eine FPLC-Methode etabliert. Das gereinigte Enzym wurde biochemisch charakterisiert und dessen kinetische Parameter für verschiedene Substrate bestimmt. Die rPsaDyP besitzt ein N-terminales Signalpeptid mit einer Länge von 62 Aminosäuren, das reife Enzym besteht somit aus 453 Aminosäuren. Das Enzym hat - vergleichbar zu anderen Peroxidasen dieser Familie - ein pH-Optimum im sauren Bereich und ist bei diesen Bedingungen über mehrere Stunden stabil. Der pI ist jedoch außergewöhnlich hoch und liegt im neutralen Bereich. Die rPsaDyP wird abhängig vom Substrat durch Wasserstoffperoxid bei vergleichsweise niedrigen Konzentrationen inhibiert. Die Analyse mittels Blue Native PAGE und Aktivitätsfärbung mit ABTS zeigte, ebenso wie die Gelfiltrationschromatographie, dass das aktive Enzym als Dimer (115 kDa) vorliegt. Die Untersuchung des Substratspektrums zeigte, dass das rekombinant produzierte Enzym neben einigen klassischen Peroxidase-Substraten auch natürliche Xanthophyllfarbstoffe abbaut. b-Carotin wurde durch die rPsaDyP in An- und Abwesenheit von H2O2 abgebaut, wobei die Enzymaktivität durch den Zusatz von H2O2 gesteigert wurde. Dies deutet darauf hin, dass die rPsaDyP neben der Peroxidase auch eine Oxidasefunktion besitzt. Die rPsaDyP kann aufgrund ihrer hohen Affinität zu dem Anthrachinonfarbstoff RB5, einem charakteristischen Substrat der DyP-Typ Peroxidasen, auch funktionell diesen Peroxidasen zugeordnet werden.

Aus den biochemischen und kinetischen Charakteristika der rekombinanten Arylalkoholoxidase und der rPsaDyP wurden Bedingungen für den Einsatz beider Enzyme in einem System abgeleitet. Die beiden Enzyme wurden kinetisch aufeinander abgestimmt und ein Zwei-Enzym-System etabliert. Dabei wurde das von der Arylalkoholoxidase bei der Oxidation von Veratrylalkohol zu Veratrumaldehyd produzierte H2O2 von der Peroxidase verbraucht. Die untersuchten Modell-Verbindungen wurden im Zwei-Enzym-System effizient umgesetzt. Der Einsatz des Zwei-Enzym-Systems im Labormaßstab zur Oxidation von Ligninkomponenten und zur Bleichung von mit Annatto gefärbter Molke verlief erfolgreich.

Die in Trichoderma reesei exprimierte GDS(L)-Lipase (in Kooperation mit AB Enzymes) aus dem Sekretom von Pleurotus sapidus zeigt nur sehr geringe Homologien zu bereits charakterisierten Lipasen/Esterasen. Die katalytischen Eigenschaften des Enzyms wurden bestimmt und die Substratspezifität des Enzyms in Abhängigkeit von der Acyl-Kettenlänge verschiedener p-Nitrophenylester ermittelt. Aufgrund der höheren Aktivität gegenüber Substraten mit längeren Acyl-Ketten kann das Enzym funktionell den Lipasen zugeordnet werden. Untersuchungen der Hydrolyse von Ferulasäuremethylester und Ferulasäureestern von Polysacchariden zeigten eine geringe Umsetzung dieser Substrate. Daher ist die Art der Beteiligung dieser sekretierten Lipase am Abbau von Lignocellulosen noch unklar. Eine Esterase aus dem Sekretom von Pleurotus sapidus wurde in Hansenula polymorpha heterolog in unlöslicher Form exprimiert. Durch denaturierende Solubilisierung und Rückfaltung wurde kein aktives Enzym gewonnen.


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