Kernspinresonanzspektroskopie an Molekularen Maschinen mit Hilfe der Dynamischen Kernpolarisation
Lange, Sascha - Freie Universität Berlin (2013)
Die dynamische Kernpolarisation (DNP) ermöglicht es, die Sensitivität der Kern-Magnetresonanz-Spektroskopie (NMR-Spektroskopie) um zwei bis drei Größenordnungen zu steigern. Grundlage der DNP ist der Transfer der relativ starken Polarisation ungepaarter Elektronen auf benachbarte Atomkerne. Eine erfolgreiche Implementierung dieser Technik in das Standard-Repertoire der Festkörper-NMR würde zu einem enormen Fortschritt in der Strukturbiologie führen. So sollte es beispielsweise möglich sein, Peptide und Proteine in ihrer nativen Umgebung zu untersuchen. Um die DNP effektiv nutzen zu können, müssen jedoch mindestens zwei grundlegende Bedingungen erfüllt sein: Das Vorhandensein ausreichender Mengen freier Elektronen (bzw. Radikalen) in der Probe sowie ein Absenken der Probentemperatur auf unter 100 K. Beide Bedingungen können jedoch zu einer signifikanten Signalverbreiterung führen und so die Interpretation der aufgezeichneten Spektren im Sinne der Strukturaufklärung erschweren.
Ein Ziel dieser Arbeit war daher, zunächst den Einfluss des derzeit am häufigsten verwendeten Biradikals (TOTAPOL) auf die NMR-Signale zu untersuchen.
In weiteren Versuchen wurde der Einfluss tiefer Probentemperaturen auf die NMR-Signale untersucht. Abschließend wurde mittels DNP-verstärkter Festkörper-NMR der Faltungszustand naszierender Ketten innerhalb stabil arretierter Ribosomen untersucht. Bei dieser molekularen Maschine limitiert die Größe der Ribosomen wesentlich die Analyt-Konzentration und erschwert zudem die selektive Detektion von NMR-Signalen der naszierenden Kette. Unter Verwendung der DNP und eines Doppelquantenfilters war es dennoch möglich, Signale zu detektieren welche eindeutig und ausschließlich der naszierenden Kette zugeordnet werden können. Eine Zuordnung von einzelnen Signalen zu bestimmten Seitenketten wurde dabei auf Grundlage von Punktmutationen durchgeführt. Diese zugeordneten Signale wurden anschließend verwendet, um den Faltungszustand der naszierenden Kette zu analysieren. Dazu wurden in erster Linie sekundäre Chemische Verschiebungen von Serin-Signalen ermittelt und mit statistischen Werten verglichen.
Insgesamt konnte gezeigt werden, dass bereits mit den heute zur Verfügung stehenden DNP-Spektrometern und Biradikalen gut aufgelöste Spektren von Proteinen in einer weitgehend nativen Umgebung aufgezeichnet werden können. Entscheidend bei der Durchführung der DNP-Experimente sind dabei sowohl die Wahl einer geeigneten Biradikal-Konzentration als auch eine optimale Proben-Präparation. Es konnte gezeigt werden, dass die Auflösung und damit die Interpretierbarkeit der aufgezeichneten Spektren, im Wesentlichen durch die Veränderung der Dynamik einzelner Seitenketten bei tiefen Temperaturen bestimmt wird. Biradikale, welche eine langsame Elektronenrelaxation aufweisen, könnten einen effektiven Polarisationstransfer bei hohen Temperaturen ermöglichen und so die Bedeutung der DNP in der NMR-gestützten Strukturforschung maßgeblich steigern.