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Proteomische, biochemische und biophysikalische Untersuchungen zu phosphorylierungsabhängigen Interaktionen des Immunzellproteins ADAP

Kuropka, Benno - Freie Universität Berlin (2015)


T-Zellen gehören zu den Hauptakteuren der zellvermittelten Immunität. Ihre besondere Fähigkeit zur Migration und Adhäsion ist entscheidend für die Auslösung einer Immunantwort. Änderungen der Adhäsions- und Migrationseigenschaften von T-Zellen werden über die stimulationsabhängige Aktivierung von Adhäsionsmolekülen, den Integrinen, vermittelt. Das Adapterprotein ADAP ist ein zentraler Bestandteil eines größeren Proteinkomplexes, der sich stimulationsabhängig assembliert und so die Affinität und Avidität von Integrinen reguliert. In seiner Funktion als Adapterprotein wird ADAP an mehreren Tyrosinresten phosphoryliert und vermittelt hierüber zahlreiche Interaktionen wie beispielsweise mit den Adapterproteinen SLP76 und NCK sowie der Tyrosinkinase FYN.

In der vorliegenden Arbeit konnten erstmals alle FYN-abhängigen Tyrosin-Phosphorylierungsstellen von ADAP systematisch und zeitabhängig charakterisiert werden. Hierunter befanden sich die Tyrosinreste 462 und 571, für die bisher keine Interaktionspartner bekannt waren. Der Tyrosinrest 571 wurde darüber hinaus in zahlreichen unabhängigen phosphoproteomischen Studien identifiziert. Mit Hilfe von SILAC-basierten Pulldown-Experimenten in Kombination mit quantitativer Massenspektrometrie konnten potentielle Interaktionspartner der phosphorylierten Tyrosinreste 462 und 571 ermittelt werden, wobei synthetische Peptidsequenzen als Köder verwendet wurden. Da sich die Position Y571 am Rand der strukturierten hSH3N-Domäne von ADAP befindet, wurden zudem rekombinant hergestellte und in vitro phosphorylierte Proteinkonstrukte als Köder eingesetzt. Interessanterweise konnte die Tyrosinkinase ZAP70 als neuer Interaktionspartner der Y571-phosphorylierten hSH3N-Domäne identifiziert werden. Mit Hilfe von NMR- und MST-Untersuchungen konnte eine direkte, phosphorylierungsabhängige Interaktion der hSH3N-Domäne mit der N-terminalen SH2-Domäne von ZAP70 bestätigt werden (KD = 2,3 μM). Darüber hinaus konnte in funktionellen Studien mit Jurkat T-Zellen gezeigt werden, dass der Tyrosinrest 571 in ADAP selektiv an der chemokinvermittelten gerichteten Migration sowie der Aktin-Polymerisation beteiligt ist, während kein Einfluss auf die zelluläre Adhäsion und Konjugatbildung mit APCs beobachtet wurde. Eine Entfernung von ADAP zeigte erwartungsgemäß Defekte sowohl der Migration als auch der Adhäsion, so dass mit dem Tyrosinrest Y571 eine kritische Determinante zur Unterscheidung dieser unterschiedlichen Funktionalitäten von ADAP identifiziert werden konnte.

Die Identifizierung niedrig abundanter Bindungspartner in AP-MS-Experimenten wird durch den hohen Überschuss des Köderproteins in der Präparation erschwert. Im zweiten, methodisch orientierten Teil dieser Arbeit konnte ein einfaches und robustes Verfahren zur kovalenten und gerichteten Immobilisierung von synthetischen Peptiden sowie rekombinant hergestellten Proteinen mittels Sortase A entwickelt werden. Das Verfahren wurde erfolgreich in Peptid- und Protein-basierten Pulldown-Experimenten eingesetzt.


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