Festkörper-NMR-Spektroskopie am ABC-Transporter ArtMP-J aus G. stearothermophilus
Kunert, Britta - Freie Universität Berlin (2011)
Die ATP-binding cassette-Transporter (ABC-Transporter) nutzen die Energie aus der ATP-Hydrolyse für die unidirektionale Translokation verschiedenster Substrate über biologische Membranen. Auf Grund ihrer bedeutenden Rolle in physiologischen und pathophysiologischen zellulären Prozessen ist die Aufklärung ihres komplexen molekularen Mechanismus der Substrattranslokation von großem medizinischem Interesse.
In der vorliegenden Arbeit werden verschiedene Konzepte zur strukturellen Charakterisierung des ABC-Transportsystems ArtMP-J aus G. stearothermophilus mittels Festkörper-NMR-Spektroskopie beschrieben, die als Grundlage für weiterführende NMR-Studien zu Struktur und Dynamik des Transporters dienen sollen. Der große Vorteil dieser Technik beruht darauf, dass Membranproteine in einer nativen Lipidumgebung strukturell und dynamisch untersucht werden können. ArtMP-J ist für den Import polarer Aminosäuren über die Zytoplasmamembran verantwortlich.
Das langfristige Ziel ist die strukturelle und dynamische Charakterisierung des gesamten Transportkomplexes, eingebettet in seine native Lipidumgebung. Für eine bessere Differenzierung zwischen den NMR-Signalen von ArtP und ArtM im Proteinkomplex wurde ArtMP so präpariert, dass der Komplex aus einer markierten und einer unmarkierten Untereinheit zusammengesetzt ist. Hierzu wurden Methoden zur Herstellung und Assemblierung der einzelnen Untereinheiten zu einem intakten Transportkomplex etabliert. So wurde die Präparation einer stabilen NMR-Probe, die aus markiertem ArtP und unmarkiertem ArtM besteht und in Lipide aus G. stearothermophilus eingebettet ist, ermöglicht. Die Nukleotidbindedomäne ArtP wurde isoliert (3D-Kristalle) sowie im Transmembrankomplex ArtM(P) (2D-Kristalle) in verschiedenen nukleotid-gebundenen Zuständen mittels 13C-13C- Korrelationsexperimenten untersucht, wobei die Proteine selektiv mit den Aminosäuren Threonin, Tyrosin und Prolin (TYP) 13C, 15N-markiert waren.
Parallel dazu wurden 1H-detektierte Festkörper-NMR-Techniken zur strukturellen Untersuchung von ArtP und ArtMP angewendet. Hierfür wurde ein Präparationsprotokoll zur Herstellung von [15N, 13C, 2H/1H]-markiertem ArtPDCN etabliert. Die hoch aufgelösten Festkörper-INEPT-Spektren von ArtM(PDCN) zeigten gute Übereinstimmung mit dem 1H-15N-Lösungs-NMR-Spektrum von ArtPDCN, so dass die Zuordnung einzelner Signale auf die Festkörper-NMR-Spektren übertragen werden konnte. Es konnten mittels 13C-13C- als auch 1H-15N-Korrelationsexperimenten gezeigt werden, dass sich die Konformation von ArtP in 3D-Kristallen von der im Komplex ArtM(P) in nativen Lipiden unterscheidet. Davon zeigten die Aminosäurereste Gly 197/212 und Leu 14 unterschiedliche chemische Verschiebungen in den Spektren von ArtM(PDCN) ohne bzw. mit Nukleotid.
Zukünftig sollten Untersuchungen an den einzelnen Untereinheiten des intakten Transportkomplexes in nativen Lipiden durchgeführt werden, um Struktur und Funktion von ArtMP nahe an seinem nativen Zustand zu charakterisieren.