Molekulare Analyse des pleiotropen ABC-Transporters Pdr5 aus S. cerevisiae
Küppers, Petra - Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf (2010)
Der ATP-binding cassette (ABC)-Transporter Pdr5 ist der Hauptvertreter der pleiotropen Drogenresistenz (PDR) der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. Er gehört zu einer besonders vielfältigen Familie von Membrantransportproteinen, die durch die Hydrolyse von ATP den Transport einer Vielzahl strukturell und funktionell unterschiedlicher Substanzen über die Membranen vermitteln.
ABC-Transporter sind ubiquitär und kommen in allen Bereichen des Lebens vor. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die hohen Expressionslevel von Pdr5 in einem genetisch modifizierten PDR1-3 Expressionsstamm genutzt, um eine allgemein anwendbare Klonierungs-kassette zur Expression und Reinigung unterschiedlicher Membranproteine über einen Affinitätstag zu etablieren. Die Evaluation erfolgte dabei durch eine standardisierte Aufreinigung unterschiedlicher Transportsysteme der Hefe, die den Einsatz der entwickelten Strategie als High-Throughput Methode bestätigen konnte. Im zweiten Teil wurde der PDR ABC-Transporter Pdr5 als Modellsystem detailliert untersucht. Die Bedeutung dieser Transportsysteme in klinisch relevanten Erkrankungen ist eindeutig definiert, allerdings ist das molekulare Verständnis bezüglich der exakten Mechanismen in der Bereitstellung der Energie und der engen Verknüpfung von Substraterkennung und -translokation bislang noch sehr limitiert. In diesem zentralen Teil der Arbeit wurde der Exporter durch gezielte Mutationen funktionell in vivo und in angereicherten Plasmamembran Präparationen auf seine ATPase- und Transportaktivität untersucht.
Eine katalytische Dyade aus einem Histidin und einem Glutamat als funktionelle Einheit des ATP-Hydrolyse Mechanismus konnte dabei für Pdr5 eindeutig ausgeschlossen werden, obwohl dieses Wirkprinzip bislang mit den meisten analysierten ABC-Transportern in Einklang gebracht werden konnte. Lediglich das Glutamat ist für die Pdr5 spezifische Aktivität essentiell, während das Histidin keinen Einfluss auf die basale ATPase Aktivität ausübt. Stattdessen beeinflusste die Mutation des konservierten Histidins (H1068A) selektiv den Substratransport, die eine Entkopplung der ATPase Aktivität in Pdr5 vom Transport bestimmter Substrate wie Rhodamin 6G belegte. Des Weiteren wurde die PDR spezifische Degeneration der ansonsten konservierten Konsensussequenzen analysiert, die eine funktionelle Asymmetrie der NBDs mit einer katalytisch aktiven (C-Terminus) und einer regulatorischen ATP-Bindungstasche (N-Terminus) bestätigte. Die Rekonstruktion der degenerierten Motive zur Generierung symmetrischer NBDs führte zum vollständigen Verlust der Aktivität, während die Mutation einzelner Motive teilweise gar keinen Effekt bewirkten.
Einen Einblick in die Mechanismen der Substratselektvität der pleiotropen ABC-Transporter wurde durch die gezielte Analyse der proteinspezifischen Interaktionen mit Substraten, Modulatoren und Energiequellen ermöglicht. Dabei wurde nicht nur die tatsächliche Funktion des Modulators FK506 als Substrat von Pdr5 identifiziert, sondern auch die spezifische sensorische Funktion eines konservierten Serins in der putativen Substratbindetasche. Die Substratselektivität wird dabei ebenfalls durch die NBDs definiert, sei es durch eine Mutation wie z.B. beim H-loop (H1068A) oder durch die Wahl der Energiequelle, die jeweils zu einer Verschiebung des Substratspektrums führen können. Der Einfluss wird dabei vermutlich durch eine Kombination von physikalisch, thermodynamischen und kinetischen Faktoren bestimmt, die in einem vereinfachten Kinetik Model zusammengefasst werden können. Letztlich scheint die nicht-stimulierbare, hohe ATPase Aktivität der PDR ABC-Transporter in Kombination mit der konservierten Degeneration in den NBDs die Funktionalität und Selektivität dieser besonderen Familie von MDR-Transportern zu definieren, was sich auch in dem differentiellen Hydrolysemechanismus widerspiegelt.