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Asparaginsäure-vermittelte enzymatische Reaktionen

Kühnel, Lisa C. - Universität Stuttgart (2016)


Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Untersuchung der Promiskuität zweier Enzyme aus unterschiedlichen Proteinklassen, die allerdings auf eine gemeinsame, in der Biochemie sehr häufige Reaktion, die Säure-(Base)-Reaktion, zurückgreifen. Beide Enzyme verwenden die Asparaginsäure als katalytisch aktive Aminosäure, wobei Haloalkan Dehalogenasen aus der alpha/beta-Hydrolase-Familie, die deprotonierte Form der Asparaginsäure als nukleophiles Aspartat verwenden, wohingegen die Squalen-Hopen-Zyklasen die protonierte Asparaginsäure als Brønsted-Säure nutzen. Das Substratspektrum der Dehalogenase LinB aus Sphingobium japonicum, das sonst nur halogenierte Alkane umfasst, sollte um alternative Substrate erweitert werden.

Es konnte erfolgreich demonstriert werden, dass LinB eine eindeutige Hydrolyseaktivität gegenüber organischen Thiocyanaten und Isothiocyanaten aufweist, was auf erstmals beschriebene promiskuitive Eigenschaften der LinB schließen lässt. Es konnte gezeigt werden, dass Substrate von unterschiedlicher Größe toleriert werden, um dabei Alkohole und Amine zu generieren. Mittels rationalem Design konnten Varianten erzeugt werden, die eine deutliche Verbesserung gegenüber der Bildung von Benzylamin demonstrierten.

Zur Untersuchung der Art der Promiskuität, wurden sogenannte knockout-Mutanten der katalytischen Triade der LinB erstellt und für Studien bezüglich des Katalysemechanismus herangezogen. In der Tat konnte über die einfache Substratpromiskuität hinaus, katalytische Promiskuität der LinB in Bezug auf die organischen Isothiocyanate gezeigt werden. Anhand der Squalen-Hopen-Zyklase aus Alicyclobacillus acidocaldarius (AacSHC) wurden Untersuchungen bezüglich intermolekular katalysierter Reaktionen vorgenommen. Diese Fähigkeit der Etherbildung ist zwar bei der nativen AacSHC anhand des Substrates Farnesol bekannt, allerdings nur in geringem Umfang. So konnte mittels Varianten aus einer fokussierten Mutantenbibliothek eine 10-fache Steigerung der Produktbildung erzielt werden. Ferner konnten unter Verwendung nicht-natürlicher Substrate und unterschiedlicher Nukleophile neue, nicht-literaturbekannte intermolekular gebildete Produkte dargestellt werden. Durch die Wahl des Nukleophils und dessen Konzentration gelang es, Produktverhältnisse eindeutig zu Gunsten der intermolekular gebildeten Produkte zu verschieben.


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