Proteomische und biophysikalische Analyse GYF-Domänen-vermittelter Interaktionen
Kosslick, Daniela - Freie Universität Berlin (2012)
GYF-Domänen bezeichnen eine kleine Familie von Protein-Interaktionsdomänen, die prolinreiche Sequenzen (PRS) binden und über die Erkennung dieser mit anderen Proteinen interagieren. Benannt sind sie nach dem konservierten Motiv aus Glycin, Tyrosin und Phenylalanin (GYF) innerhalb der Domäne, das direkt an der Bindung des Liganden beteiligt ist. Aus dem Sequenzvergleich verschiedener GYF-Domänen wurden zwei Unterfamilien, die der CD2BP2- und Smy2-ähnlichen GYF-Domänen, definiert. Neben Sequenz- und Strukturunterschieden der Unterfamilien, sind sie auch in Proteinen unterschiedlicher Zellkompartimente enthalten. Während Proteine mit einer Domäne vom CD2BP2-Typ mit dem Spleißprozess im Zellkern assoziiert sind, weisen Proteine mit einer GYF-Domäne vom Smy2-Typ eine zytoplasmatische Lokalisation auf.
Es gibt bereits erste Hinweise auf Interaktionspartner der GYF-Domänen, jedoch ist die biologische Funktion von GYF-Proteinen noch weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde das direkte Interaktom der GYF-Domänen der humanen Proteine CD2BP2 und GIGYF2, sowie des Hefeproteins Smy2 mit dem Ziel untersucht, weitere Hinweise auf ihre Funktion zu erhalten. Hierzu wurden die isolierten GYF-Domänen in Pulldown-Experimenten eingesetzt und ihre Bindungspartner über Massenspektrometrie (MS) bestimmt. Durch Ausnutzung der quantitativen MS konnte eine spezifische Identifizierung des Interaktoms der jeweiligen PRS-Bindungsstellen durchgeführt werden. Für GIGYF2 und Smy2 war dies die erste Charakterisierung PRS-vermittelter Bindungspartner. Für CD2BP2 wurden bereits bestehende Interaktomdaten in einem organspezifischen Kontext neu untersucht.
Da eine Vielzahl essentieller, intrazellulärer Prozesse auf der Erkennung prolinreicher Sequenzen durch PRS-Bindungsdomänen (PRDs) beruht, ist diese Interaktion auch von therapeutischem Interesse. Daher wurden im zweiten Teil dieser Arbeit zwei Strategien zur spezifischen Inhibition dieser Proteininteraktion betrachtet. Die Validierung der Inhibitionsmethoden, entweder durch ein Peptidmimetikum oder durch ein Kleinmolekül, erfolgte durch NMR-spektroskopische Bindungsstudien.
In dieser weitreichenden Untersuchung direkter Bindungspartner der GYF-Domänen konnten neue, noch unbekannte Interaktionen ermittelt werden. Insbesondere die Daten für GIGYF2 und Smy2, Proteine, die sich durch eine zytoplasmatische Lokalisation und eine GYF-Domäne vom Smy2-Typ auszeichnen, lieferten Hinweise auf eine konservierte Funktion. Beide Proteine können im Kontext bereits beschriebener Funktionen und mittels der Ergebnisse dieser Arbeit in Verbindung mit mRNA-prozessierenden Proteinen und der vesikulären Transportmaschinerie gebracht werden. Für CD2BP2 legt die deutliche Expression in hämatopoetischen Organen adulter Mäuse eine potentielle Funktion im Immunsystem nahe. Auch wenn keine neuen, direkten Bindungspartner ermittelt wurden, untermauern die Ergebnisse die Assoziation mit spleißosomalen Komplexen. Darüber hinaus ist eine Funktion in Kombination mit weiteren mRNA-prozessierenden Proteinen im Zellkern möglich.
Während die Suche nach einem Kleinmolekül keine geeigneten Inhibitoren hervorbrachte, ergaben sich aus der Untersuchung des Peptidmimetikums erste Hinweise auf mögliche Ansatzpunkte zur Inhibition der PRS/PRD-Interaktion. Obwohl das Peptidmimetikum kein hoch affiner Ligand der GYF-Domäne war, ist es als Ausgangspunkt für weitere Optimierungsschritte nützlich.