Nachweis von Xenobiotika in alternativen Matrices mittels Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie: Methodenentwicklung und neue Einsatzmöglichkeiten in der Forensischen Toxikologie und Klinischen Chemie
Kempf, Jürgen - Albert-Ludwigs-Universität Freiburg (2014)
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung massenspektrometrischer Methoden zum Nachweis von Drogen- und Medikamentenwirkstoffen in verschiedenen alternativen Matrices. Als "alternative Matrix" werden in der forensischen Toxikologie alle Körperflüssigkeiten und Gewebe bezeichnet, die neben den klassischen Untersuchungsmaterialien Blut, Urin, Haare und Mageninhalt, zum Nachweis oder Ausschluss einer Wirkstoffaufnahme untersucht werden. Gründe hierfür sind beispielsweise der Mangel an klassischen Untersuchungsmaterialien, der weniger invasive Aufwand bei der Probengewinnung oder unterschiedliche Nachweisfenster. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die alternativen Matrices Speichel, Zahnhartsubstanz und Glaskörperflüssigkeit mittels Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) untersucht.
Für die Speichelanalytik wurden Methoden zum quantitativen Nachweis von Benzodiazepinen, Methylphenidat und synthetischen Cannabinoiden entwickelt. Es konnte gezeigt werden, dass ungekühlte Lagerung bzw. Versand von mittels Dräger DCD 5000 asservierten Speichelproben zu teilweise großen Verlusten bei der Wiederfindung führt. Diese konnten durch Zugabe von 950 µl Methanol bzw. Ethanol auf den Probengeber minimiert werden, und führte zu der Empfehlung an die Anwender vor Ort, die Probennehmer Methanol-stabilisiert zu versenden bzw. den Probennehmer zeitnah zu zentrifugieren und das Eluat vom Mundstück getrennt zu lagern. Mit der validierten Methode zum Nachweis von synthetischen Cannabinoiden bestand erstmalig die Möglichkeit, den Konsum dieser neuen psychoaktiven Substanzen in einer nicht-invasiv gewonnen Matrix nachzuweisen. Die mit dem Verfahren erhaltenen Ergebnisse decken sich qualitativ weitgehend mit denen parallel entnommener Blutproben.
Zur Beurteilung einer Beeinflussung anhand einer Speichelprobe müsste ein konstanter Speichel/Serum-Koeffizient für die betreffende Substanz vorliegen. Dies wurde in der Literatur anhand eines Einzelfalles für Methylphenidat postuliert, konnte in einer hier durchgeführten klinischen Studie jedoch nicht bestätigt werden. Bei den 24 Probanden zeigte sich, dass insbesondere die Menge und die damit verbundene Zusammensetzung des sezernierten Speichels einen großen Einfluss auf die im Speichel nachweisbare Methylphenidat-Konzentration hatten. Speichel stellt somit auf Grund der einfachen, nicht-invasiven Probennahme eine geeignete alternative Matrix für den Nachweis oder den Ausschluss einer Aufnahme der hier genannten Wirkstoffe dar. Ein Rückschluss auf die vorliegende Serum-Konzentration zum Zeitpunkt der Probennahme ist jedoch nicht möglich.
Bei der Untersuchung von humaner Zahnhartsubstanz konnte gezeigt werden, dass sich mittels LC-MS/MS die Antibiotika Amoxicillin und Clindamycin nach einmaliger peroraler Gabe einer therapeutischen Dosis im Zahn nachweisen lassen. Durch Simulation der im Mundraum ablaufenden De- und Remineralisationszyklen mit einem pH-Cycling, bei dem künstlicher Speichel mit gängigen Missbrauchsdrogen dotiert wurde, konnten Dentin- und Schmelzproben von Rindzähnen mit den verwendeten Modellsubstanzen dotiert werden. Die im Dentin nachgewiesenen Wirkstoffkonzentrationen lagen dabei im Schnitt um den Faktor 10 höher als im Schmelz. Dies bestätigt die Hypothese, dass auf Grund der physiko-chemischen Eigenschaften der jeweiligen Gewebe eine Einlagerung von Wirkstoffen aus dem Speichel in den Zahn, wenn überhaupt, nur in geringem Ausmaß stattfindet und der Großteil der Substanzen über die Blutbahn der Pulpa in die Zahnhartsubstanz gelangt. Erste Untersuchungen an humanem Zahnmaterial von nach Drogen- oder Medikamentenkonsum Verstorbenen zeigten, dass sich neben den bei in-vitro Versuchen verwendeten Modellsubstanzen eine große Zahl von Missbrauchsdrogen in der Zahnhartsubstanz nachweisen lassen.
Neben den bisher verwendeten klassischen LC-MS/MS-Verfahren wurde zudem ein schnelles und robustes Screening-Verfahren zum Nachweis von Drogen- und Medikamentenwirkstoffen in biologischen Matrices mittels Ionenfallen-MS entwickelt. Die durchgeführte Methoden-Evaluierung an Real- und dotierten Proben, die Ermittlung von Nachweisgrenzen, Vergleiche mit etablierten LC-MS-Verfahren sowie ein Interlabor-Vergleich zeigten, dass der entwickelte Workflow unabhängig von der untersuchten Matrix den Anforderungen an ein Screening-Verfahren zur Analyse von Körperflüssigkeiten entspricht. So konnten mit der Methode sowohl Serum- und Urinproben klinischer und forensischer Fälle als auch Glaskörperflüssigkeit im Rahmen der Leichentoxikologie schnell und effizient analysiert werden.
Die im Rahmen dieser Dissertation untersuchten Möglichkeiten der Analytik von alternativen Matrices und das neue MS-basierte Screeningverfahren können nicht nur in der klinischen Diagnostik eingesetzt werden, sondern erweitern auch die Möglichkeiten der Interpretation in der post-mortalen forensischen Toxikologie gerade dann, wenn keine klassischen Matrices vorhanden sein sollten.